廖曉峰，于榮，梁華正，嚴(yán)根華（東華理工大學(xué)，江西南昌330038）

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磷酸改性花生殼固定化α-淀粉酶研究

廖曉峰，于榮*，梁華正，嚴(yán)根華
（東華理工大學(xué)，江西南昌330038）

摘要：以磷酸改性花生殼為載體固定α-淀粉酶，研究改性后的花生殼吸附固定α-淀粉酶的最優(yōu)固定化條件以及固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明：用磷酸溶液對粉碎的花生殼顆粒進(jìn)行浸泡處理來改性，研究出酶固定化最優(yōu)條件是：酶液/載體比11∶1（mL/mg），緩沖液pH6.0，固定時(shí)間8h和溫度35℃。經(jīng)3次平行試驗(yàn)，所得實(shí)際固定化酶活力平均值為27 980 U/g。對游離酶和固定化酶部分酶學(xué)性質(zhì)比較，得出改性固定化后酶的最適反應(yīng)pH、溫度有所改變，為pH= 6.0，溫度45℃，其儲存時(shí)間、操作穩(wěn)定性和耐熱性比游離酶更好。

關(guān)鍵詞：改性花生殼；固定化酶；磷酸

固定化酶技術(shù)既指用固體材料將酶束縛在一定的密閉空間內(nèi)，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用的一類技術(shù)。酶的固定方法分主要分為化學(xué)和物理方法，化學(xué)方法為交聯(lián)法和共價(jià)法，物理方法為吸附法和包埋法共4大類［1-4］：吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)法。共價(jià)法是利用酶蛋白分子上的官能團(tuán)和固定化載體表面上的基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵而使酶固定化的的方法，α-淀粉酶表面上有多種可利用的化學(xué)基團(tuán)，比如羥基、巰基等，本論文α-淀粉酶的固定化就是使用這一技術(shù)。

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，也是花生生產(chǎn)大國，花生年產(chǎn)量達(dá)到1 500萬t，為世界第一，占全球花生產(chǎn)量的2/5以上。在花生加工過程中會產(chǎn)生大量的花生殼廢棄物，我國每年產(chǎn)生的花生殼廢棄物高達(dá)500萬t之多［5］。

共價(jià)法通常是指用化學(xué)試劑對花生殼顆粒進(jìn)行活化處理，不僅可以改善花生殼的孔狀結(jié)果，還可以增加花生殼上的官能團(tuán)數(shù)量，增強(qiáng)花生殼的吸附能力?；罨ㄉ鷼こＳ玫幕瘜W(xué)試劑有：檸檬酸、飽和KOH、磷酸、硫酸等［6-10］。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

1.1.1儀器

試驗(yàn)儀器見表1。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

試驗(yàn)試劑見表2。

表1　試驗(yàn)常用儀器Table 1 The mainly used equipments in the experiment

表2　試驗(yàn)試劑Table 2 The real test reagents

1.1.3試驗(yàn)原料

α-淀粉酶：上海藍(lán)季發(fā)展有限公司；花生殼：產(chǎn)地南昌。

1.2原料處理

1.2.1花生殼

將花生殼剪碎，直徑1 mm～2 mm大小，然后與蒸餾水充分混勻，浸泡24 h，過濾掉懸浮細(xì)小物質(zhì)，在45℃下烘干備用。

1.2.2花生殼改性

稱取10 g未改性已烘干的花生殼粉置于500 mL的燒杯中，加入100 mL 1 mol/L的磷酸緩沖液溶液，攪拌8 h后，抽濾去除液體部分，在45℃下烘干，用蒸餾水清洗，在45℃下烘干后備用。

1.3測定方法

1.3.1淀粉酶活力的測定方法

α-淀粉酶的酶活力定義：在45℃，pH 5.6磷酸緩沖液的條件下，每反應(yīng)15 min消耗1 mg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/g）［8］。

游離酶的酶活力測定方法：將2%的可溶性淀粉溶液100 μL作為底物放入燒杯中，加入pH 5.6的1 mol/L醋酸緩沖液100 μL和400 μL蒸流水的混合溶液，隨后加入1 g的α-淀粉酶，混勻后置于45℃的水浴鍋中準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，反應(yīng)后立即加入0.1 mol/L的鹽酸1.0 mL終止反應(yīng)。取反應(yīng)液1.0 mL放入10 mL的比色管中，加入1.0 mL稀碘液后用蒸流水定容至10.0 mL，放在540 nm波長下比色。以相同量的淀粉酶和蒸餾水溶液為對照組，根據(jù)多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)消耗的葡萄糖的量。取3次的平均值為最終結(jié)果值［8］。

固定化酶的酶活力測定方法：試驗(yàn)方法同上述游離酶的酶活力測定方法，取一定量的固定化酶溶液經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂屘鎿Q以上的游離α-淀粉酶。測定是以3次結(jié)果為平均值。酶的相對酶活是指：在同一組試驗(yàn)中，以活性最高的一組為100%，其余的酶活力與之相比，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.2可溶性淀粉溶液中多糖含量的測定方法

1.3.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法：分別精確吸取2.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mL和蒸餾水2.00、1.60、1.40、1.30、1.20、1.10、1.00 mL，配制成濃度為0.4 mg/mL～1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列。分別吸取0.5 mL上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL的比色管中，加入1.0 mL DNS試劑，沸水浴5 min。待溶液冷卻至室溫后，用蒸館水定容至10 mL，搖勻后放在540 nm波長下比色，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，算出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程。（Y=AX+B）

反應(yīng)后的樣品在室溫下放置15 min，若出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象則放在3 000 r/min的離心機(jī)離心10 min，以上清液以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，在540 nm波長處測定樣品空白A和樣品溶液B的吸光值，B-A為實(shí)際吸光值。用直線回歸方程計(jì)算樣品α-淀粉酶的活性。

1.3.2.2淀粉酶活力U

淀粉酶活性U按下式計(jì)算：

式中：U為樣品淀粉酶活性，U/mL；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；F為樣品溶液的總量，mL；S為樣品測試量；式中S為1 mL；60為1 h為60 min；15為反應(yīng)時(shí)間，min。

固定化酶的酶活力和改性之后的測定方法：試驗(yàn)方法同上述游離酶的酶活力測定方法，測定時(shí)做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取其平均值。

1.4固定化α-淀粉酶的單因素條件試驗(yàn)

1.4.1酶液/載體比的確定

取6個(gè)三角瓶，在緩沖液pH6.0，固定溫度35℃，固定時(shí)間5 h條件下，按酶液/載體（mL/mg）分別為2∶1、5∶1、8∶1、11∶1、14∶1和17∶1的配比進(jìn)行固定，分別用去蒸餾水洗滌3次，過濾抽干，檢測固定化酶活力。

1.4.2固定化時(shí)間對酶固定化活性的影響

取6個(gè)三角瓶，分別加入9 mL酶液和1 g改性花生殼，于35℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中，分別固定4、6、8、10、12、14 h，固定完成后，抽干過濾，用蒸餾水洗滌濾紙上的固定化酶3次，晾干，測定固定化酶活力。

1.4.3固定化溫度的選擇

取6個(gè)三角瓶，分別加入9 mL酶液和1 g改性花生殼，分別置于25、30、35、40、45、50℃，120 r/min恒溫振蕩搖床內(nèi)固定6 h，固定完成后抽干過濾，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測出酶的活力。

1.4.4緩沖液pH對酶固定化的影響

用不同pH的磷酸緩沖液將α-淀粉酶液分別配成pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的酶液。取6個(gè)三角瓶，分別加入9 mL酶液和1 g改性花生殼，于35℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中固定6 h，固定完成后的處理步驟同上，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測出酶的活力。1.5改性花生殼固定化a淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)［9-10］

1.5.1游離酶與固定化酶酶最適pH比較

在酶的固定化溫度為35℃、固定化時(shí)間為6 h、及固定化酶用磷酸鹽緩沖液的pH為6.0的情況下，測定的固定化葡萄糖氧化酶的活性為100。

游離酶最適反應(yīng)pH的測定方法：取1 g游離酶和固定化酶，按照酶活力測定的方法在體系中分別加入pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的1 mol/L的緩沖液100 μL，將配制好的體系置于35℃的水浴鍋中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，而后分別計(jì)算出其相對酶活力。每組試驗(yàn)設(shè)置3次平行試驗(yàn)。

1.5.2游離酶與固定化酶的最適溫度比較

分別將游離酶與固定化酵在25、35、45、55、65、75℃的水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，分別測定游離酶與固定化酶的相對酶活力。每組試驗(yàn)設(shè)置3次平行試驗(yàn)。繪制出游離酶和固定化酶在不同溫度條件下的相對酶活力曲線。比較游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)溫度是否發(fā)生改變。

1.5.3固定化酶的貯藏穩(wěn)定性

將游離酶和固定化好的酶儲存在4℃冰箱4、8、12、16、20、24、28 d，分別測定各自的酶活力以及計(jì)算出酶相對活力。比較兩者的儲存穩(wěn)定性。

1.5.4固定化酶的操作穩(wěn)定性

將游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶在pH=6的緩沖液，溫度35℃與2%淀粉溶液反應(yīng)15 min，反應(yīng)后過濾抽干，繼續(xù)使用反應(yīng)。總共反應(yīng)6次，分別測出酶活力和相對酶活力。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制見表3。葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表3　葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Table 3 Draw the standard curve of glucose

圖1　葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2改性花生殼固定α-淀粉酶的單因子試驗(yàn)

2.2.1酶液/載體比對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力的影響

按不同的酶液/載體比對改性花生殼固定α-淀粉酶活力的影響見圖2。

圖2　不同酶液/載體比對酶活力影響Fig.2 Different enzyme/carrier ratio effect on the enzyme activity

從圖2中可以看出隨著酶液/載體的增大，固定化酶的相對活力呈先增大后減小的趨勢，但之后下降的趨勢變小，總體上保持不變，當(dāng)酶液/載體為11∶1（mL/mg）時(shí)，固定化酶活力最高。這是因?yàn)楣潭ɑd體可吸附的酶量是有限的，當(dāng)固定化載體相對較少時(shí)，可能由于每個(gè)載體分子表面吸附的蛋白量相對過多，造成酶分子相互聚集成團(tuán)，酶分子的活性中心有可能被遮蓋，因此，酶液/載體的較適值為11∶1（mL/mg）。

2.2.2緩沖液pH對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力影響

在不同的pH環(huán)境中改性花生殼固定α-淀粉酶的結(jié)果見圖3。

圖3　緩沖液pH對酶活力的影響Fig.3 pH corresponds to the impact of enzyme activity

從圖3中可以看出，緩沖液pH不同，固定化酶活力也不同。當(dāng)緩沖液pH為6.0時(shí)，固定化酶活力相對較高；改性花生殼在酸性環(huán)境中固定α-淀粉酶好于在堿性環(huán)境中固定α-淀粉酶。原因是酸性緩沖液可以改變酶分子和固定化載體的離子化狀態(tài)，另外酶作為一種蛋白質(zhì)，當(dāng)溶液pH超出一定范圍時(shí)，微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，從而引起酶變性失活。因此緩沖液pH是影響固定化α-淀粉酶催化活力的重要因素，最適值在6.0。

2.2.3固定化時(shí)間對改性α淀粉酶活性的影響

固定時(shí)間對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　固定化時(shí)間對酶活力的影響Fig.4 Immobilization of time corresponding to the enzyme activity

從圖4中可以看出，固定時(shí)間也是影響固定化酶活力的因素之一，α-淀粉酶和載體結(jié)合需要一段時(shí)間，但是并不是時(shí)間越長越好，這是因?yàn)棣?淀粉酶為蛋白質(zhì)，時(shí)間越長會導(dǎo)致部分活力損失。所以，改性花生殼固定α-淀粉酶的時(shí)間為8 h左右。

2.2.4固定化溫度對α淀粉酶活性的影響

固定化溫度對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力的影響結(jié)果見圖5。

圖5　不同固定化溫度對酶活力的影響Fig.5 Effect of different immobilized on the enzyme activity

從圖5中可以看出，固定化酶活力隨著溫度上升活力升高，在35℃達(dá)到最高值29 700 U/g，之后隨著溫度上升活力下降，可以看出之后的下降速度明顯較快。因此α-淀粉酶的固定化溫度因?yàn)?5℃。在40℃以后酶活力就由于高溫開始失活。

2.3改性花生殼固定化α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1游離酶與固定化酶酶最適pH比較

在酶的固定化溫度為35℃、固定化時(shí)間為6 h、及固定化酶用磷酸鹽緩沖液的pH為6.0的情況下，測定的固定化酶的活性為100（酶活力為：29 950 U/g）見表4。

表4　不同pH對游離酶和固定化酶相對酶活的影響Table 4 pH corresponds to a different free enzyme and the relative activity of the immobilized enzyme

從表4可以看出不同pH有不同的酶活力，從游離酶和固定化酶相對酶活力可以看出，pH在6之前一直升高，在6之后就逐漸下降，游離酶最適pH=6.0，最高活力為29 100 U/g左右；固定化酶最適pH為6.0，最高酶活力為30 000 U/g左右。

2.3.2游離酶與固定化酶最適反應(yīng)溫度比較

不同溫度對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響見表5。

表5　不同溫度對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響Table 5 Corresponding to the free enzyme at different temperatures and relative activity of the immobilized enzyme

從表5中可以看出游離酶和固定化酶最適反應(yīng)溫度分別在40℃和45℃左右。游離酶在45℃之后相對酶活性下降較快而固定化酶下降較緩慢。固定化酶在75℃還能保持66.8%。游離酶卻只有28.4%左右?？赡苁且?yàn)楦男怨潭ɑ蟾淖兞甩?淀粉酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)使得酶的熱耐受力較強(qiáng)，因此可以看出固定化酶熱穩(wěn)定性較好。

2.3.3固定化酶的貯藏穩(wěn)定性

不同儲存時(shí)間下對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響見表6。

表6　不同儲存時(shí)間下對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響Table 6 Different storage time relative activity of the free enzyme and immobilized enzyme

游離酶在放置一周后酶活下降的幅度較大，在28 d后酶活性保持在57.8%左右，而改性固定化α-淀粉酶相對酶活在28 d后還保持在78%?？芍潭ɑ?淀粉酶的儲存穩(wěn)定性較好。

2.3.4固定化酶的操作穩(wěn)定性

不同操作次數(shù)對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響見表7。

表7　不同操作次數(shù)對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響Table 7 Different operating frequency corresponds to the free enzyme and the relative activity of the immobilized enzyme

操作穩(wěn)定性可以從固定化酶的連續(xù)使用效果看出。如果制備的固定化酶在操作2到3次以后其酶活力就大幅度下降，那么固定化酶就失去了一定應(yīng)用價(jià)值。由表7可以看出，固定化α-淀粉酶的酶活力隨著使用次數(shù)的增加呈下降的趨勢，但是下降的幅度較緩慢，連續(xù)進(jìn)行6次操作以后，固定化α-淀粉酶的相對酶活仍然可以保持在第一次酶活力的71.4%，相比游離酶在操作6次后55.1%而言，固定化α-淀粉酶具有良好的操作性。

3　結(jié)論

本研究以磷酸改性花生殼為載體固定α-淀粉酶，研究了改性后的花生殼吸附固定α-淀粉酶的最優(yōu)固定化條件以及固定化酶的一些酶學(xué)性質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明：用磷酸溶液對粉碎的花生殼顆粒進(jìn)行浸泡處理進(jìn)行改性，研究出酶固定化最優(yōu)條件是：酶液/載體比11∶1（mL/mg），緩沖液pH 6.0，固定時(shí)間8 h和溫度35℃。經(jīng)3次平行試驗(yàn)，固定化酶活力平均值為27 980 U/g。

對游離酶和固定化酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較，得出改性后固定化后酶的最適反應(yīng)pH、溫度有所改變，最適pH=6.0，最適溫度為45℃，固定化酶儲存時(shí)間、操作穩(wěn)定性和耐熱性比游離酶都更好。

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Modified Peanut Shells on α- Amylase Immobilized by Phosphoric Acid

LIAO Xiao-feng，YU Rong*，LIANG Hua-zheng，YAN Gen-hua
（East China Institute of Technology，Nanchang 330038，Jiangxi，China）

Abstract：A modified peanut shells as α-amylase immobilized on the enzymatic properties of the immobilized enzyme was detected，study the modified peanut shells fixed α-amylase adsorption optimal immobilization conditions and immobilized enzyme enzymatic properties. The results showed that：enzyme immobilization devel oped optimal conditions were：enzyme / carrier 11∶1（mL/mg）buffer pH6.0，8 h fixed time and Temperature 35℃. After three parallel experiments，the resulting immobilized enzyme actual average of 27 980 U/g. The free enzyme and immobilized enzymatic properties comparison，the immobilized enzyme modified optimum pH，temperature changes，as pH = 6.0，temperature was 45℃. At the same storage time，number of operations and the heat resistance was more than the free enzy.

Key words：modified peanut shells；immobilized enzyme；phosphoric acid

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.007

作者簡介：廖曉峰（1965—），男（漢），教授，碩導(dǎo)，博士，從事食品藥品分析。

*通信作者：于榮（1965—），女，高級實(shí)驗(yàn)師，從事化學(xué)分析工作。

收稿日期：2015-03-15