崔傳金， 張　孔， 張瑞成， 田景瑞

(1.華北理工大學(xué) 唐山市先進(jìn)測(cè)試與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063009；2.華北理工大學(xué) 唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

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綜述與評(píng)論

生物傳感器檢測(cè)牛奶病原微生物的研究進(jìn)展*

崔傳金1， 張孔1， 張瑞成1， 田景瑞2

(1.華北理工大學(xué) 唐山市先進(jìn)測(cè)試與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063009；2.華北理工大學(xué) 唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

摘要:牛奶中病原微生物的含量是衡量牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，生物傳感器在牛奶病原微生物檢測(cè)方面有較好的優(yōu)勢(shì)。介紹了生物傳感器的組成和原理，并詳細(xì)綜述了近幾年電化學(xué)生物傳感器和質(zhì)量敏感型生物傳感器在牛奶中病原微生物的定量檢測(cè)中的研究現(xiàn)狀，探討了未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：生物傳感器； 牛奶； 病原微生物； 檢測(cè)方法

0引言

牛奶是一種營(yíng)養(yǎng)成分較全、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的生活必備食品,其質(zhì)量關(guān)系到食品安全問(wèn)題，評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量最重要的一個(gè)參數(shù)就是菌落總數(shù)(total bacterial count，TBC)[1,2]，菌落總數(shù)是指每毫升牛奶中含有的細(xì)菌個(gè)數(shù)。理論上健康奶牛的牛奶中不含細(xì)菌，若奶牛患有乳腺炎疾病或外界污染，新鮮牛奶中就會(huì)存在細(xì)菌。牛奶中常含多種微生物[3]，其中，金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、結(jié)核桿菌等病原菌對(duì)牛奶質(zhì)量及奶牛健康狀況有較大的影響。各國(guó)都制定了牛奶中微生物含量的最高標(biāo)準(zhǔn)[2]，加拿大為TBC≤5×104cfu/mL，歐盟、新西蘭和美國(guó)A級(jí)為TBC≤10×104cfu/mL，美國(guó)B級(jí)為TBC≤30×104cfu/mL，而中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)最低，最新的GB 19301—2010規(guī)定：TBC≤200×104cfu/mL，是加拿大標(biāo)準(zhǔn)的40倍。

目前，有多種檢測(cè)方法在牛奶病原微生物的檢測(cè)中得到了應(yīng)用[4],如，顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法(標(biāo)準(zhǔn)方法)、核酸擴(kuò)增檢測(cè)法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)法、光譜檢測(cè)法、生物傳感器檢測(cè)法等。其中，生物傳感器檢測(cè)法具備靈敏度高、特異性好、檢測(cè)準(zhǔn)確、檢測(cè)時(shí)間短、成本低廉、操作簡(jiǎn)單、能現(xiàn)場(chǎng)使用的優(yōu)點(diǎn)，商業(yè)應(yīng)用前景廣闊。本文就生物傳感器在牛奶病原微生物檢測(cè)方面的研究和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1生物傳感器構(gòu)成與原理

生物傳感器結(jié)合了物理學(xué)、信息科學(xué)、生命科學(xué)和分析化學(xué)等知識(shí)和技術(shù)，是多學(xué)科交叉的產(chǎn)物。其基本組成和原理如圖1所示，主要由生物敏感膜(生物分子識(shí)別元件)和換能器兩部分組成，生物敏感膜可以是酶、組織、全細(xì)胞、高分子聚合物模擬酶等，生物敏感膜可直接固定在換能器表面，但很多固定在換能器表面的基膜上(納米薄膜等)，基膜在提高傳感器性能、延長(zhǎng)分子識(shí)別元件活性方面有重要作用；換能器可以是電極、熱敏電阻器、光纖、壓電晶體、微懸臂梁等。基本原理[5]為：待檢測(cè)的物質(zhì)通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入固定化生物敏感膜層，經(jīng)過(guò)分子識(shí)別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生電、熱、光、聲、質(zhì)量等信息，然后被相應(yīng)的換能器轉(zhuǎn)變成可定量處理的電信號(hào)，再經(jīng)信號(hào)處理，最后顯示被測(cè)物質(zhì)的濃度。

圖1　生物傳感器原理Fig 1　Principle of biosensor

2生物傳感器在牛奶病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)[6]、食品安全[7]和環(huán)境監(jiān)測(cè)[8]等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。在牛奶病原微生物檢測(cè)方面，電化學(xué)生物傳感器和質(zhì)量敏感型生物傳感器的研究較多[9]，近幾年的研究現(xiàn)狀總結(jié)如下。

2.1電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是以電化學(xué)傳感器作為基礎(chǔ)電極與生物活性材料組成的生物傳感器。由于其具有換能器便宜，不受牛奶濁度的影響，傳感器檢測(cè)過(guò)程輸出的電信號(hào)可直接在電路中轉(zhuǎn)換等優(yōu)點(diǎn)，不僅降低了儀器的復(fù)雜性而且有利于儀器的微型化和集成化。

Sireesha Chemburu等人[10]自主開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)牛奶中大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、曲狀桿菌含量的電化學(xué)酶聯(lián)免疫生物傳感器。該傳感器采用雙抗體夾心法，以高度分散的碳粒子固定抗體捕獲牛奶樣品中的病原微生物，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體再與病原菌特異性結(jié)合構(gòu)成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，加入酶催化底物根據(jù)產(chǎn)生電流的大小與病原微生物的含量成比例的關(guān)系來(lái)檢測(cè)病原菌的含量。牛奶樣品中的大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、曲狀桿菌的檢測(cè)限分別為50，10，50 cells/mL，檢測(cè)時(shí)間為30 min。Lin Y H等人[11]同樣采用雙抗體夾心法，制作了電化學(xué)酶聯(lián)免疫生物傳感器，用絲網(wǎng)印刷炭電極作為固相載體，并且用二茂鐵二羧酸(FeDC)和納米金對(duì)電極進(jìn)行了修飾，起到電流信號(hào)的放大作用。對(duì)牛奶中大腸桿菌Escherichia coli(E.coli)O157∶H7檢測(cè)下限為50 cfu/strip，檢測(cè)時(shí)間1 h。Vig Attila等人[12]也用類似非直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫的方法，用阻抗型免疫生物傳感器檢測(cè)了牛奶中黃曲霉毒素(aflatoxin M1，AFM1)的含量。在石墨絲網(wǎng)印刷電極(SPCE)上膠鏈AFM1的復(fù)合物，根據(jù)抗原—抗體免疫結(jié)合的原理，游離的AFM1與復(fù)合物上納米金膠標(biāo)記的AFM1抗體結(jié)合，電化學(xué)沉積得到的銀離子用來(lái)放大檢測(cè)信號(hào)，計(jì)算得到的電荷傳遞電阻Rct與AFM1的含量密切相關(guān)，檢測(cè)范圍為15～1 000 ng/mL，檢測(cè)下限為15 ng/mL。

Zelada—Guillén G A等人[13]開(kāi)展了基于核酸適配體的生物傳感器檢測(cè)牛奶中大腸桿菌的研究工作。該傳感器的基本原理為：核酸適配體共價(jià)結(jié)合單壁碳納米管修飾的電極，與牛奶樣品中的大腸桿菌E.coli O157∶H7相互作用產(chǎn)生電壓的變化，從而間接地檢測(cè)出牛奶中細(xì)菌的含量，快速檢測(cè)線性響應(yīng)達(dá)到104 cfu/mL，響應(yīng)時(shí)間短。Luo Caihui等人[14]也開(kāi)展了基于核酸適配體的生物傳感器檢測(cè)牛奶中大腸桿菌E.coli O111的研究工作。該傳感器利用巰基—金綁定方法將捕獲探針錨定在金電極的表面，大腸桿菌的核酸適配體再通過(guò)與捕獲探針雜交固定在金電極的表面。當(dāng)加入大腸桿菌測(cè)時(shí)大腸桿菌與適配體劇烈作用適配體會(huì)從探針上脫離下來(lái)，形成的單鏈捕獲探針會(huì)與標(biāo)記有堿性磷酸酶的生物素化的檢測(cè)探針雜交，對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生非常敏感的酶催化的電化學(xué)響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的檢測(cè)，傳感器有很好的特異性。在牛奶中的檢測(cè)限為305 cfu/mL，檢測(cè)時(shí)間為3.5 h。

Laczka O等人[15]研制出一種檢測(cè)牛奶中致病性大腸桿菌E.coli O157∶H7的電化學(xué)免疫傳感器?；跈z測(cè)辣根過(guò)氧化氫HRP酶在催化苯二酚(hydroquinone，HQ)介質(zhì)中的過(guò)氧化氫(H2O2)時(shí)的活性的原理，并運(yùn)用了微流控技術(shù)和微磁珠技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)電流的大小來(lái)檢測(cè)病菌的含量，在牛奶樣品的分析和檢測(cè)中，檢測(cè)限達(dá)到100 cells/mL，受其他雜菌的干擾較小。Esteban-Fernández devila 等人[16]應(yīng)用電化學(xué)免疫傳感器對(duì)牛奶中金黃色葡萄球菌檢測(cè)進(jìn)行研究。antiProtA抗體固定在ProtA修飾的磁珠上，與包括標(biāo)記有HRP的抗原的物質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定。修飾的磁珠被磁場(chǎng)富集在四硫富瓦烯修飾的金印刷電極(Au/SPEs)的表面，加入H2O2后電極系統(tǒng)產(chǎn)生電流響應(yīng)，這種傳感器的檢測(cè)限很低，在原奶中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限可達(dá)1 cfu/mL，檢測(cè)時(shí)間為2 h。汪學(xué)英等人[17]開(kāi)展了“原位制備納米功能化金電極傳感器”檢測(cè)牛奶中大腸桿菌的研究工作。根據(jù)納米功能化薄膜對(duì)細(xì)胞膜上脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)具有顯著的催化作用，而對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生電流響應(yīng)的原理，以計(jì)時(shí)電流法電流響應(yīng)作為輸出信號(hào)進(jìn)行對(duì)細(xì)菌的測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到在1.1×103～2.5×107cfu/mL的微生物檢測(cè)范圍內(nèi)，響應(yīng)電流和細(xì)菌數(shù)量呈線性關(guān)系。

Sung Yunju等人[18]利用基于抗體/納米金/納米磁珠復(fù)合材料的傳感器檢測(cè)牛奶中沙門氏桿菌。根據(jù)抗原—抗體免疫吸附原理捕獲牛奶中的病原菌，根據(jù)過(guò)濾系統(tǒng)使得病原微生物富集，然后根據(jù)顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的不同實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的，檢測(cè)限為1.5×105cfu/mL，檢測(cè)時(shí)間為40 min。

Wu Haiyun等人[19]應(yīng)用免標(biāo)記阻抗免疫電化學(xué)傳感器對(duì)牛奶中布魯氏菌含量進(jìn)行快速定量檢測(cè)。其原理為：根據(jù)電化學(xué)阻抗法，提取在金納米絲網(wǎng)碳電極固定的布魯氏菌及其抗體在界面處的信號(hào)，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立等效模型表示菌液和電極組成體系，并分析了模型中元件與菌液含量的關(guān)系，檢測(cè)分析得出(40～400)×104/mL之間的布魯氏菌與電極傳遞阻抗存在明顯的線性關(guān)系，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶樣品中的布魯氏菌的1×104/mL和40×104/mL檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間少于1.5 h。

周永軍等人[20]基于電化學(xué)傳感器設(shè)計(jì)了一種實(shí)時(shí)檢測(cè)牛奶中含菌量系統(tǒng)。該系統(tǒng)基于細(xì)菌代謝過(guò)程和基質(zhì)氧化還原機(jī)理設(shè)計(jì)制作電化學(xué)傳感器，利用色素還原法通過(guò)對(duì)細(xì)菌氧化還原作用而生成的電子數(shù)計(jì)測(cè)，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌數(shù)的測(cè)定。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到該傳感器輸出的電壓與電流較好地反映了牛奶中細(xì)菌的數(shù)目，測(cè)量區(qū)間為103～1012cfu/mL，檢測(cè)下限為103cfu/mL，測(cè)量時(shí)間10 min。寧毅[21]開(kāi)展了基于碳納米管生物傳感器快速檢測(cè)牛奶中甲型副傷寒沙門氏菌的研究工作。該傳感器利用碳納米管和以羧基熒光素修飾的具有雙重檢測(cè)功能的核酸探針，通過(guò)檢測(cè)熒光值的增加和吸光度的增加可以對(duì)牛奶中甲型副傷寒沙門氏菌進(jìn)行定量檢測(cè)。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得,以熒光信號(hào)和吸光度所測(cè)出的最低檢測(cè)下限分別為105，106cfu/mL。該方法同時(shí)利用兩種信號(hào)來(lái)檢測(cè)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，降低了假陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生的可能性。

2.2質(zhì)量敏感型生物傳感器

質(zhì)量敏感型傳感器主要有壓電生物傳感器和無(wú)線磁彈性生物傳感器。壓電生物傳感器工作原理是：將生物活性物質(zhì)固定于晶體表面，得到頻率f1，將晶片置于被測(cè)的氣體或液體中，當(dāng)生物活性物質(zhì)與被測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成復(fù)合物后，再測(cè)晶片的頻率f2，從而得到Δf=f2-f1，再由Sauerbrey方程[22]Δf=-2.26×10-6f2Δm/A就可以得到被測(cè)物質(zhì)的量。由于頻率測(cè)定可以達(dá)到很高的精度，因此，可以有很高的檢測(cè)限。無(wú)線磁彈性生物傳感器工作原理是:在外加交變磁場(chǎng)中，傳感器產(chǎn)生磁致伸縮。當(dāng)外加交變磁場(chǎng)頻率與傳感器振動(dòng)頻率相等時(shí)，傳感器產(chǎn)生共振，對(duì)應(yīng)的振動(dòng)頻率為傳感器共振頻率。當(dāng)傳感器表面性質(zhì)發(fā)生變化，其共振頻率隨之改變。其伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的磁通可由檢測(cè)線圈檢測(cè)到，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)線傳感[23]。

戴高鵬等人[24]以串聯(lián)式壓電傳感器為基礎(chǔ)構(gòu)建了一臺(tái)自動(dòng)化微生物檢測(cè)儀，實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)。其原理為:微生物分解牛奶改變其中的成分，從而改變液相體系中的電導(dǎo)介電常數(shù)等參數(shù)，進(jìn)而改變頻率的變化，從而測(cè)得牛奶中病原菌的含量。檢測(cè)范圍為10～106cells/mL，檢測(cè)時(shí)間為3～15 h。后來(lái)用這種檢測(cè)方法對(duì)含有大腸桿菌的牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)研究，其檢測(cè)范圍仍可達(dá)到10～106cells/mL，且此方法準(zhǔn)確度和平板計(jì)數(shù)法相當(dāng)(r≧0.99)[25],但檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)。Shen Zhiqiang等人[26]應(yīng)用壓電型生物傳感器檢測(cè)1 mL奶樣中大腸桿菌E.coli O157∶H7含量。該傳感器為石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)免疫傳感器，利用標(biāo)記性免疫磁珠納米粒子、金探針和含有E.coli O157∶H7的 mL奶樣進(jìn)行特異性結(jié)合，通過(guò)樣品中金粒子的催化生長(zhǎng)引起QCM表面質(zhì)量變化，由質(zhì)量變化引起諧振頻率變化，從而檢測(cè)出1 mL奶樣中E.coli O157∶H7的含量，檢測(cè)限為53 cfu/mL，重復(fù)利用率至少為10次，檢測(cè)時(shí)間為4 h。結(jié)果表明，該傳感器在檢測(cè)牛奶中大腸桿菌含量方面具有高度專一性和穩(wěn)定性。

Lakshmanan R S等人[27]應(yīng)用磁彈性無(wú)線生物傳感器對(duì)牛奶中沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)研究。該傳感器的基本原理是：在選擇層固定噬菌體，利用噬菌體捕獲牛奶樣品中的沙門氏菌，以此改變傳感器傳出的磁彈性頻率，從而獲得牛奶樣品中沙門氏菌的含量，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到其檢測(cè)限為5×103cfu/mL，線性范圍擴(kuò)展到5×107cfu/mL，分析1 mL奶樣用時(shí)20 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該傳感器具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、實(shí)時(shí)檢測(cè)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是在穩(wěn)定性、造價(jià)、避免牛奶抑制性影響等方面有待改善。Huang Sijing等人[28]研究制備了檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌含量的磁彈性無(wú)線生物傳感器。該傳感器在密閉的容器內(nèi)對(duì)牛奶樣品的含菌量進(jìn)行定量、實(shí)時(shí)的檢測(cè)，牛奶樣品中金黃色葡萄球菌含量改變，牛奶的粘度改變，導(dǎo)致傳感器的共振頻率變化，從而間接地檢測(cè)出牛奶中金黃色葡萄球菌的含量，檢測(cè)范圍為103～107cells/mL。研究表明：該傳感器在原位、遠(yuǎn)程實(shí)時(shí)和定量檢測(cè)牛奶質(zhì)量方面的可行性。黃思靜等人[29]應(yīng)用磁彈性無(wú)線生物傳感器對(duì)牛奶中金黃色葡萄球菌開(kāi)展研究工作。其共振頻率隨牛奶中金黃色葡萄球菌的細(xì)菌濃度的改變而改變，濃度可以通過(guò)傳感器共振頻率的增大或減小進(jìn)行定量分析，線性范圍104～107cells/mL，檢出限為104cells/mL，且傳感器的共振頻率大小與菌液濃度呈線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.98。

3結(jié)束語(yǔ)

本文綜述了近幾年電化學(xué)生物傳感器和質(zhì)量敏感型生物傳感器在牛奶病原微生物檢測(cè)方面的研究進(jìn)展。其中，電化學(xué)生物傳感器方面的研究較多，尤其是免疫型電化學(xué)生物傳感器的研究最為豐富；質(zhì)量敏感型生物傳感器近年來(lái)也有一些研究，主要靠檢測(cè)頻率的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)病原微生物含量的目的。另外，納米技術(shù)和納米材料在生物傳感器上的應(yīng)用，使電化學(xué)和質(zhì)量型生物傳感器檢測(cè)的選擇性和靈敏度都大幅度的提高。然而，大多數(shù)檢測(cè)牛奶質(zhì)量的生物傳感器限于在實(shí)驗(yàn)室的研發(fā)，并且其識(shí)別元件的壽命、穩(wěn)定性和非特異性結(jié)合方面依舊存在一定的局限性，不能完全實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶復(fù)雜體系的實(shí)時(shí)、在線、超靈敏自動(dòng)化檢測(cè)。

隨著新型納米材料的合成、加工和集成技術(shù)不斷發(fā)展完善，芯片技術(shù)、微流控技術(shù)等將會(huì)在生物傳感器中得到廣泛的應(yīng)用，不斷提高傳感器的性能。生物傳感器技術(shù)的不斷進(jìn)步，必然在集成化、微型化方面有很好的體現(xiàn)，未來(lái)將會(huì)在牛奶病原微生物檢測(cè)方面發(fā)揮重要的作用。

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Research progress of biosensor for pathogenic microorganism detection in milk*

CUI Chuan-jin1， ZHANG Kong1， ZHANG Rui-cheng1， TIAN Jing-rui2

(1.Tangshan Key Laboratory of Advanced Measurement and Control Technology,North China University of Science and Technology,Tangshan 063009,China;2.Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases,North China University of Science and Technology，Tangshan 063000,China)

Abstract:The content of pathogenic microorganism in milk is one of the important indexes of milk quality,biosensor has strong advantages in detecting pathogenic microorganism in milk.The composition and principle of biosensor are introduced,recent advances in electrochemical and quality sensitive biosensors used in pathogenic microorganism detection in milk in the past decade are reviewed in detail,together with a discussion of future development trends.

Key words:biosensor; milk; pathogenic microorganism; detection method

DOI:10.13873/J.1000—9787(2016)02—0001—04

收稿日期：2015—06—15

*基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(F2015209308)

中圖分類號(hào)：TP 212.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000—9787(2016)02—0001—04

作者簡(jiǎn)介:

崔傳金(1982-),男，山東淄博人，博士，講師，研究方向?yàn)樯飩鞲衅鳌y(cè)控技術(shù)與智能儀器。