岑　毅, 劉　威

(武漢大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

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基于熒光的流式細(xì)胞檢測與分選*

岑毅, 劉威

(武漢大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

摘要:利用微流控技術(shù)相關(guān)軟硬件實(shí)現(xiàn)了快速檢測的流式細(xì)胞術(shù)。使用玻璃基質(zhì)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片。將結(jié)腸癌HTC116細(xì)胞用羅丹明B染色，通過流動(dòng)聚焦以液滴包裹，利用激光誘導(dǎo)熒光(LIF)共聚焦檢測法檢測細(xì)胞,利用放大電路和濾波電路采集微弱光電信號(hào)。然后根據(jù)檢測結(jié)果，利用電潤濕方法(EWOD)將HTC116細(xì)胞分離出來。通過單片機(jī)RS—232串口將信號(hào)傳送到PC端，在屏幕上顯示檢測結(jié)果，并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)。該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了快速流式細(xì)胞檢測、計(jì)數(shù)與分選。癌細(xì)胞的放大后的信號(hào)為900～1 300 mV,對(duì)于濃度為2×106/mL細(xì)胞樣品可以8 min檢測完畢。

關(guān)鍵詞:流式細(xì)胞術(shù)； 共聚集檢測； 電潤濕； 信號(hào)采集

0引言

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)是 20 世紀(jì) 70 年代初發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù) ,結(jié)合了微流控技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、生物與化學(xué)技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)用于實(shí)驗(yàn)室研究各種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，以及臨床上對(duì)疾病的監(jiān)測診斷。流式細(xì)胞分析中，細(xì)胞首先用熒光染料染色，或者是熒光染料標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合，然后單個(gè)細(xì)胞依次通過檢測通道，從而進(jìn)行細(xì)胞分析和疾病診斷[1]。

利用流式細(xì)胞術(shù)可以實(shí)現(xiàn)精確的高通量檢測和分選。利用流動(dòng)聚焦(flow focusing)法可以產(chǎn)生單分散的液滴，包裹住單個(gè)細(xì)胞，以單列通過檢測通道。檢測技術(shù)主要有光學(xué)檢測和電化學(xué)檢測方法。光學(xué)檢測靈敏度高，與樣品無接觸，設(shè)備簡單且易于與微流控芯片相集成。光學(xué)檢測方法可分為熒光檢測、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光檢測、拉曼光譜檢測等。激光誘導(dǎo)熒光( LIF) 可以精確控制激發(fā)光的參數(shù)，其敏感性更高，成為微流控技術(shù)中最主要的光學(xué)檢測方法之一[2]。

傳統(tǒng)的細(xì)胞分選方法有電場分選法[3]、聲表面波分選法[4]、流體動(dòng)力學(xué)分選法[5]和微閥分選法[6]等。使用電場控制反應(yīng)速度快，對(duì)液滴無需標(biāo)記，能降低溝道的復(fù)雜程度。Ahn B等人使用裸露的電極對(duì)液滴充電，然后利用靜電場對(duì)液滴分選[3]，充電電壓為80 V，分選電壓為110 V。郭峰等人使用靜電場對(duì)沒有預(yù)充電的液滴進(jìn)行分選，利用了液滴自身由于其他原因所帶的電荷[7]，使用的電壓為300～1 200 V。傳統(tǒng)的電場分選方法所需的電壓較高[7]，經(jīng)常達(dá)到千伏以上，高電壓會(huì)引起絕緣層的擊穿、電化學(xué)反應(yīng)以及對(duì)生物樣品的損害。電潤濕(electro-wetting)方法，是一種無接觸的電場操控方法，操控電壓較低[8]。

本文以激光誘導(dǎo)熒光檢測和電潤濕分選方法為基礎(chǔ)，開發(fā)了熒光檢測和電潤濕分選的硬件電路，配合微流控平臺(tái)和相關(guān)的軟件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HTC116結(jié)腸癌細(xì)胞的快速檢測、計(jì)數(shù)與分選。

1系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

系統(tǒng)主要包括：1)微流控芯片與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) ；2)激光光源與光束形成系統(tǒng)；3)熒光接收與放大系統(tǒng)；4)數(shù)據(jù)顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng) ；5)細(xì)胞分選系統(tǒng)。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1　系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig 1　Structure diagram of system

1.1微流控芯片與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

將HTC116細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)懸液與3 %海藻酸鈉溶液以1︰2的體積比混合，作為離散相，進(jìn)行流動(dòng)聚焦，得到均勻大小的液滴，液滴中包裹細(xì)胞。通過恒流泵將細(xì)胞懸液與連續(xù)相(油)通入芯片，利用流動(dòng)聚焦法生成單分散的液滴，液滴中包裹細(xì)胞，并以另一路油相調(diào)節(jié)液滴移動(dòng)速度。

1.2激光光源與光束形成系統(tǒng)

液滴依次單列通過光學(xué)檢測系統(tǒng)，激光器發(fā)出的激光聚焦到溝道中的一個(gè)點(diǎn)上，激發(fā)出癌細(xì)胞上的熒光。

采用共聚焦模式激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)，同側(cè)激光入射與熒光收集，其光路結(jié)構(gòu)如圖2所示。激光器發(fā)射波長532 nm的激光，功率100 mW，經(jīng)前置帶通濾光片(532±10)nm濾光，再通過分光濾光鏡和物鏡組1聚焦于微流控芯片的溝道。誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光經(jīng)帶通濾光片(590±10)nm濾光后，通過物鏡組2聚焦進(jìn)入小孔，由光電倍增管將其轉(zhuǎn)換為微弱電流信號(hào)。

圖2　激光光源和熒光探測結(jié)構(gòu)Fig 2　Laser source and fluorescence detection structure

平臺(tái)移動(dòng)聚焦是利用步進(jìn)電機(jī)控制平臺(tái)水平方向和豎直方向移動(dòng)。水平方向移動(dòng)，使激光對(duì)準(zhǔn)微流控芯片溝道中間位置；豎直方向移動(dòng)，光電倍增管收集芯片反射的熒光，調(diào)節(jié)芯片與物鏡之間的距離，根據(jù)光強(qiáng)度判定激光是否聚焦在芯片溝道中。水平X,Y軸移動(dòng)平臺(tái)行程各為50 mm，豎直Z軸移動(dòng)平臺(tái)行程30 mm。每個(gè)軸兩端有用于保護(hù)的光電限位器，每個(gè)限位器的狀態(tài)接入單片機(jī)中斷I/O口。

1.3熒光信號(hào)放大系統(tǒng)

熒光接收系統(tǒng)是共聚焦式LIF檢測系統(tǒng)，使用濱松公司生產(chǎn)的側(cè)窗型光電倍增管R928(PMT)進(jìn)行檢測，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為微弱電信號(hào)，再進(jìn)行放大和A/D轉(zhuǎn)換。

光電倍增管接收熒光，產(chǎn)生微弱的電流，需要將電流放大。選用如圖3所示的電路，包含前置放大電路和低通濾波器。前置放大電路要求具有低噪聲，高精度的特性[9]。前置跨導(dǎo)放大電路將弱電流轉(zhuǎn)換為放大的電壓信號(hào)。選用精密JFET輸入型運(yùn)放AD8627作為前置運(yùn)算放大器。該運(yùn)放的噪聲小，0.1～10 Hz噪聲為1.9 μV；輸入偏置電流小，輸入偏置電流IB典型值0.25 pA，最大值1 pA。為了減小電路中的噪聲，采用誤差小的貼片式金屬薄膜電阻器和溫度特性好的貼片電容器。前置放大電路中，反饋電阻器并聯(lián)上電容器C1，用于補(bǔ)償信號(hào)相位，避免產(chǎn)生自激震蕩。后級(jí)采用有源二階低通濾波器，可以實(shí)現(xiàn)低通濾波和放大[10]。

圖3　微弱光電流信號(hào)放大電路Fig 3　Amplifier circuit for weak photoelectric current signal

1.4數(shù)據(jù)顯示與存儲(chǔ)

信號(hào)處理系統(tǒng)是以Atmel公司的Atmega128單片機(jī)作為控制核心搭建控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)平臺(tái)移動(dòng)、對(duì)焦、接收及上傳數(shù)據(jù)，并判斷是否對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。

數(shù)據(jù)通過RS—232串口傳送到PC端，用C#語言設(shè)計(jì)一個(gè)人機(jī)交互程序。PC端接收數(shù)據(jù)，并顯示在窗體中，可以直觀地區(qū)分有效信號(hào)與噪聲信號(hào)，并可存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.5細(xì)胞分選系統(tǒng)

細(xì)胞分選系統(tǒng)利用電潤濕效應(yīng)進(jìn)行分選。如圖4，利用自激振蕩產(chǎn)生160 kHz的正弦波，峰—峰值可達(dá)350 V，由單片機(jī)定時(shí)控制固態(tài)繼電器接通90 ms，短暫接入交變電場，作用于分選電極上，將目標(biāo)細(xì)胞分選進(jìn)分支溝道。電阻器R2,R3給振蕩管Q1提供偏置，電容器C1將振蕩電壓進(jìn)行正反饋，高頻變壓器的初級(jí)線圈是三端電感諧振線圈，中間抽頭接電源。變壓器次級(jí)線圈是高匝數(shù)高壓輸出，用于細(xì)胞分選電極。

圖4　自激振蕩電路Fig 4　Self-oscillation circuit

細(xì)胞分選利用電潤濕效應(yīng)，如圖5，在兩電極間加上交變電場，兩個(gè)電極間會(huì)產(chǎn)生一個(gè)勢阱。當(dāng)一個(gè)導(dǎo)電液滴處于兩個(gè)電極上方時(shí)，由于絕緣層的存在，形成了包括兩個(gè)串聯(lián)的平板電容的電路。靜電場引起的液滴的勢能為

相應(yīng)的靜電場力為

圖5　微溝道中的電潤濕原理圖Fig 5　Principle of electro-wetting in micro-channel

2實(shí)驗(yàn)

2.1試劑與細(xì)胞樣品

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(美國Hyclone公司)，植物油(中國北亞藥用油公司)，PDMS(美國GE—東芝有機(jī)硅公司)，PBS緩沖液(美國Hyclone公司)，Trypsin-EDTA(美國Gibco公司)，羅丹明(BCRhB,上海試劑三廠)。實(shí)驗(yàn)中獲得去離子水使用超純水凈化系統(tǒng)(Direct—Q3，美國Millipore公司)。HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞由武漢中南醫(yī)院提供。

HCT116細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)，其中添加10 %的胎牛血清，1 %的青霉素和鏈霉素等質(zhì)量混合物，在5 %的CO2氣氛中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃。細(xì)胞分裂增殖后，HCT116使用胰酶細(xì)胞消化液(美國Gibco公司)將細(xì)胞團(tuán)分散，離心，去除上清液，加入PBS溶液冷藏待用。

將PBS細(xì)胞懸液離心，使用0.4 %的羅丹明B溶液500 μL在暗室染色30 min。用0.9 %NaCl溶液清洗離心3次，用0.9 %NaCl稀釋到需要的濃度，再與3 %的海藻酸鈉溶液以1︰2的體積混合，作為實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞懸液。

2.2實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)使用恒流泵(TS2—60，中國蘭格公司)通入連續(xù)相和分散相液體，使用倒置顯微鏡(IX71，Olympus)進(jìn)行觀測，并使用CCD相機(jī)記錄液滴的運(yùn)動(dòng)情況。將細(xì)胞懸液作為分散相通入，將植物油作為連續(xù)相通入，形成穩(wěn)定的包裹細(xì)胞的單分散液滴。

打開激光光源，調(diào)節(jié)平臺(tái)移動(dòng)，使激光聚焦在溝道中心。打開PC端串口，接收放大的熒光信號(hào)，在屏幕上顯示數(shù)據(jù)。使用濃度為2×106/mL細(xì)胞懸液，可以8 min檢測完畢。

2.3熒光檢測結(jié)果

如圖6，在沒有癌細(xì)胞通過時(shí)，電路中的噪聲和細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)會(huì)引起較小的信號(hào)波動(dòng)。而有癌細(xì)胞通過時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生較高的峰。噪聲信號(hào)幅值一般不超過500 mV。癌細(xì)胞中熒光信號(hào)則會(huì)達(dá)到900 mV以上，小于1 300 mV。連接串口后，進(jìn)行信號(hào)采樣，將信號(hào)傳輸?shù)缴衔粰C(jī)，顯示到界面圖中，并能將數(shù)據(jù)以文本文檔存儲(chǔ)。

圖6　HTC116細(xì)胞熒光檢測效果Fig 6　Results of fluorescence detection on HTC116 cell

2.4分選效果

在三叉路的溝道中，使用電潤濕對(duì)液滴進(jìn)行分選。當(dāng)熒光信號(hào)強(qiáng)度超過900 mV時(shí)，單片機(jī)判定液滴包裹癌細(xì)胞，接通繼電器，進(jìn)行液滴捕獲分選。使用的芯片參數(shù)為：

溝道高度80 μm，中間溝道寬度為200 μm，分支溝道的寬度為150 μm。當(dāng)液滴進(jìn)入待分選溝道時(shí)，利用連續(xù)相將液滴調(diào)節(jié)到適當(dāng)間距。芯片上共有三個(gè)電極，當(dāng)液滴到達(dá)叉路交匯處時(shí)，在某一分支溝道兩側(cè)的電極加交變電壓，液滴由于受到電潤濕作用力，向指定的叉路運(yùn)動(dòng)。圖7(a),(b),(c)是分選的示意圖。圖7(a)中右邊電極懸空不加電場，則液滴進(jìn)入中間分支溝道；圖7(b)中驅(qū)動(dòng)電極，則液滴進(jìn)入上邊分支溝道；圖7(c)中驅(qū)動(dòng)電極，則液滴進(jìn)入另一分支溝道。實(shí)驗(yàn)中用電潤濕方法進(jìn)行不含細(xì)胞的1 %NaCl液滴的分選，圖7(d)中將一個(gè)液滴分選到上邊分支溝道；圖7(e)中將一個(gè)液滴分選到下邊分支溝道。所加的交變電壓有效值為60 V，作用時(shí)間為40 ms。

圖7　電潤濕分選Fig 7　Electro-wetting for sorting

3結(jié)論

本文利用激光誘導(dǎo)熒光檢測方法，結(jié)合軟硬件協(xié)同設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HTC116細(xì)胞快速檢測、計(jì)數(shù)和分選的流式細(xì)胞術(shù)。本方法利用共聚焦檢測，檢測與計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確；外圍信號(hào)放大與分選電路小型化，簡化了分選系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)；使用電潤濕效應(yīng)，在較低的電壓下實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的分選。使用這種芯片可以在較低的電壓下進(jìn)行液滴的捕獲和分選。

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Flow cytometry for detection and sorting based on fluorescence*

CEN Yi, LIU Wei

(School of Physics and Technology,Wuhan University,Wuhan 430072,China)

Abstract:Flow cytometry is implemented with combination of microfluidic,and its related software and hardware.Microfluidic chip is made of polydimethylsiloxane(PDMS)on substrate of slide glass.The flow focusing is used to form droplets which contain stained colorectal HTC116 cells,then laser induced fluorescence(LIF)confocal detection method is used.Amplifier and filtering circuits are utilized to detect weak photoelectric current signal.According to detection results,droplets which contain HTC116 cells are sorted by electro-wetting on dielectric (EWOD).Signals are transmitted from micro control unit (MCU) to PC by RS—232 serial port,displayed on screen and stored.Fast detection,count and sorting for cells are realized by the system.The amplified signal of HTC116 are at range of 900～1 300 mV,and detection can be completed in 8min for sample cell with concentration of 2×106/mL.

Key words:flow cytometry; confocal detection; electro-wetting; signal acquisition

DOI:10.13873/J.1000—9787(2016)03—0154—03

收稿日期：2015—06—28

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272443)；國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金資助項(xiàng)目(J1210061)

中圖分類號(hào):TN 405

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

文章編號(hào):1000—9787(2016)03—0154—03

作者簡介:

岑毅(1990-)，男，湖北棗陽人，碩士研究生，主要從事微流控與微納加工研究。