王慶,薛天樂

(亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

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追風(fēng)傘總黃酮的纖維素酶提取工藝研究

王慶,薛天樂

(亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

[摘要]采用紫外分光光度法，以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別研究了酶用量、提取時間、料液比和提取溫度對纖維素酶法提取追風(fēng)傘(Lysimachia paridiformis)中總黃酮提取率的影響，再設(shè)計正交試驗優(yōu)選最優(yōu)提取工藝。結(jié)果表明，其最優(yōu)工藝條件為：酶用量4.0mg，提取時間2.5h，料液比1∶30，提取溫度50℃。在最優(yōu)提取工藝條件下，追風(fēng)傘中的總黃酮提取率可達(dá)2.68%。因此，該方法可以用于追風(fēng)傘總黃酮的提取。

[關(guān)鍵詞]纖維素酶；追風(fēng)傘(Lysimachia paridiformis)；總黃酮

報春花科珍珠菜屬植物追風(fēng)傘(Lysimachiaparidiformis)性辛、溫，具有祛風(fēng)、活血的功效，臨床上主要用于風(fēng)濕疼痛、半身不遂等的治療[1,2]。追風(fēng)傘黃酮類化合物含量豐富,但關(guān)于其提取工藝的研究很少。為此，筆者利用纖維素酶法提取追風(fēng)傘總黃酮，以期為追風(fēng)傘的二次開發(fā)提供支持。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

追風(fēng)傘由安徽省亳州市三義堂藥業(yè)有限公司提供；蕓香苷為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；纖維素酶為湖南米純生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-205為上海予華儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；水浴鍋HH-4為金壇市普林儀器制造有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計UV2400為北京鈕因科技有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品5.5mg置于小燒杯中，加70%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，以70%乙醇稀釋至刻度線，制成濃度為0.11mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液[2]。取6支25mL容量瓶，分別編號為0、1、2、3、4、5，在上述容量瓶中依次加入蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，然后分別加入1.0mL的5%NaNO2溶液，混勻，放置6min后，分別加入1.0 mL 10%Al(NO3)3溶液，混勻并放置6min，再分別向上述容量瓶中加入10.0mL 4%NaOH溶液，70%乙醇定容，混勻，15min后在510nm波長處分別測定光密度(以0號管為空白)。以蕓香苷濃度為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

1.2.2提取步驟及樣品測定

將干燥的追風(fēng)傘粉碎成粗粉，準(zhǔn)確取追風(fēng)傘粗粉1.5g置于100mL燒瓶中，按照設(shè)計方案，以不同工藝條件進(jìn)行提取追風(fēng)傘總黃酮。90℃水浴10min滅活纖維素酶，同法提取3次，合并提取液，減壓濃縮，以70%的乙醇定容至50mL容量瓶中，得到總黃酮試液。取2.0mL總黃酮試液至25mL容量瓶中再測定各自的光密度，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算，求得總黃酮提取率。

圖1　蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.3單因素試驗

1)纖維素酶用量稱取追風(fēng)傘粗粉6份，每份1.5g，料液比1∶40(g/mL)，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg的纖維素酶用量，40℃條件下提取2h，再測定各自的光密度，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算并比較總黃酮提取率。

2)提取時間稱取追風(fēng)傘粗粉6份，每份1.5g，料液比1∶40(g/mL)，纖維素酶4.0mg，在40℃條件下分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，再測定各自的光密度，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算并比較總黃酮提取率。

3)液料比稱取追風(fēng)傘粗粉6份，每份1.5g，纖維素酶用量4.0mg，提取溫度40℃，在液料比分別為1(1∶10)、2(1∶20)、3(1∶30)、4(1∶40)、5(1∶50)、6(1∶60)的條件下提取2h，再測定各自的光密度，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算并比較總黃酮提取率。

4)提取溫度稱取追風(fēng)傘粗粉6份，每份1.5g，料液比1∶40(g/mL)，纖維素酶用量4.0mg，分別在35、40、45、50、55、60℃的溫度下提取2h，再測定各自的光密度，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算并比較總黃酮提取率。

1.2.4正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，選擇酶用量、提取時間、料液比、提取溫度4個相關(guān)因素進(jìn)行正交試驗，正交試驗因素水平如表1所示。

表1　正交試驗因素水平表

2結(jié)果與分析

2.1纖維素酶用量對總黃酮提取率的影響

圖2　纖維素酶用量對追風(fēng)傘總黃酮提取率的影響

由試驗結(jié)果(圖2)可知，當(dāng)纖維素酶用量高于3.0mg時，總黃酮的提取率增速變緩；當(dāng)纖維素酶用量高于4.0mg時，提取率幾乎不變，表明此時酶解作用已經(jīng)近似飽和。因此，當(dāng)纖維素酶用量為3.0～5.0mg較為適宜。

2.2提取時間對總黃酮提取率的影響

由試驗結(jié)果(圖3)可知，追風(fēng)傘總黃酮提取率隨著提取時間的增加而提高，但是當(dāng)提取時間超過2h時，總黃酮提取率增加不明顯。綜合考慮，提取時間以1.5～2.5h較為適宜。

2.3液料比對總黃酮提取率的影響

由試驗結(jié)果(圖4)可知，追風(fēng)傘總黃酮提取率隨溶劑的增加而增大，但當(dāng)料液比超過1∶40后，總黃酮提取率增加不明顯，這不僅造成試驗原料浪費，也為后續(xù)的蒸發(fā)濃縮帶來困難。綜合考慮，料液比應(yīng)為1∶40左右為宜。

圖3 提取時間對追風(fēng)傘總黃酮提取率的影響圖4 料液比對追風(fēng)傘總黃酮提取率的影響

圖5　提取溫度對追風(fēng)傘總黃酮提取率的影響

2.4提取溫度對總黃酮提取率的影響

由試驗結(jié)果(圖5)可知，在35℃到60℃之間時，追風(fēng)傘總黃酮提取率隨溫度升高總體呈先升后降趨勢，在50℃時總黃酮提取率最高，表明在50℃時纖維素酶活性最大，而溫度高于50℃后追風(fēng)傘總黃酮提取率有明顯下降，這可能是因為高溫抑制了酶的活性所致。

2.5纖維素酶法提取總黃酮的最優(yōu)工藝條件

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以酶用量、提取時間、料液比、提取溫度4個相關(guān)因素進(jìn)行正交試驗，結(jié)果如表2所示。根據(jù)正交試驗結(jié)果，可以確定最佳提取工藝是A2B3C1D2，即酶用量為4mg，提取時為2.5h，料液比1∶30，提取溫度50℃。4個因素對追風(fēng)傘總黃酮提取率影響的大小依次是：酶用量>提取溫度>提取時間>料液比。在最佳工藝條件下，通過實驗驗證，追風(fēng)傘總黃酮提取率可達(dá)2.68%，比文獻(xiàn)[4]報道的乙醇回流法提高了58.6%。

表2　正交試驗結(jié)果表

3結(jié)語

使用纖維素酶法提取追風(fēng)傘中的總黃酮，利用酶制劑降解植物細(xì)胞壁，可顯著增加細(xì)胞內(nèi)有效成分溶出度，提取條件溫和，操作簡便，成本較低，且提取率顯著高于乙醇回流法[5]。因此，該方法可用于追風(fēng)傘總黃酮的提取。需要指出的是，使用纖維素酶法提取追風(fēng)傘中總黃酮時，采用的溶劑為水，由于水本身極性較大，對極性較小的黃酮特別是黃酮苷元的溶解狀況不佳。針對上述情況，可嘗試使用乙醇作為提取溶劑，把酶提法和回流提取法、超聲提取法和微波提取法等結(jié)合使用來提取追風(fēng)傘總黃酮，以期獲得更高的提取率[6～8]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]向秋玲.追風(fēng)傘的化學(xué)成分研究[D].貴陽：貴州大學(xué),2007.

[2]邱凈英,徐必學(xué),楊寧線,等.追風(fēng)傘化學(xué)成分的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009，(10):2393～2394.

[3]張圣燕,張成.纖維素酶提取冬棗葉中總黃酮工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2013，(1):188～190.

[4]葉敏,孔維兵,王小英.追風(fēng)傘總黃酮提取工藝優(yōu)選及其體外抗氧化作用考察[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013,19(1)：44～46.

[5]陶文亮,李慧力.酶法在植物黃酮提取中的應(yīng)用[J].貴州化工，2010，(5):32～34.

[6]魏鳳玉,王欣.纖維素酶-乙醇協(xié)同提取黃芩總黃酮[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，(4)：575～578

[7]孟娜,魏勝華,陶玉貴,等.超聲波-酶法聯(lián)合提取絞股藍(lán)總黃酮及其抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技.2014，(3)：138～141

[8]黃靖.纖維素酶-乙醇法提取苦丁茶中總黃酮[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(23)：5445～5447，5451.

[收稿日期]2016-01-12

[基金項目]安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)重點項目(KJ2015A358)；亳州市中藥科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(BZ2013zzb06)。

[作者簡介]王慶(1982-)，女，碩士，講師，主要從事天然藥物活性成分分離純化研究，84181713@qq.com。

[中圖分類號]O652.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)09-0076-04

[引著格式]王慶,薛天樂.追風(fēng)傘總黃酮的纖維素酶提取工藝研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版) ，2016，13(9)：76～79.