徐佩，艾克特，周靜文，庹銳，萬晶

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434020)

楊代勤，許巧情

(長江大學動物科學學院，湖北荊州434020；湖北淡水健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢434070)

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15種水產(chǎn)動物致病菌生長特性及形態(tài)特征研究

徐佩，艾克特，周靜文，庹銳，萬晶

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434020)

楊代勤，許巧情

(長江大學動物科學學院，湖北荊州434020；湖北淡水健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢434070)

[摘要]采用平板培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢，對15種水產(chǎn)動物致病菌生長特性及形態(tài)特征進行了研究。結(jié)果表明，鮰愛德華氏菌只在TSA培養(yǎng)基上能正常生長，而且生長非常緩慢；腐敗希瓦桿菌B16在shieh培養(yǎng)基上能正常生長；其余細菌均能在LB培養(yǎng)基上生長。這些致病菌在形態(tài)上可分為3類：一類為球狀菌，包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌和溶壁微球菌；第二類為桿狀菌，包括枯草桿菌、嗜水氣單胞菌B11、鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌；第三類為弧狀菌，包括副溶血弧菌和河流弧菌。

[關(guān)鍵詞]致病菌；革蘭氏染色；細菌形態(tài)

細菌性疾病是魚類中最為常見而且危害較大的一類疾病。隨著養(yǎng)殖事業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)魚規(guī)模不斷擴大，以及密養(yǎng)、精養(yǎng)技術(shù)的推廣，細菌性疾病也在不斷地暴發(fā)流行。如嗜水氣單胞菌能廣泛引起淡水魚類細菌性敗血癥( 溶血性腹水病)，還可引起鱉的紅底板病、穿孔病、出血性腸道壞死癥、癤瘡病以及青蛙的紅腿病等[1]；河流弧菌可使鯉科魚類患出血性敗血癥[2]；熒光假單胞菌可使以草魚為主的多種淡水魚患赤皮病[3]；遲鈍愛德華氏菌可使鰻鱺、羅非魚等海淡水魚患紅疫病愛德華氏病，也能引起池養(yǎng)鱔魚的“紅病”和渠道鲇魚的“氣腫性腐爛病”[4]；鮰愛德華氏菌可使斑點叉尾鮰等患腸道敗血癥[5]；無乳鏈球菌可使多種魚類患鏈球菌病[6]；副溶血弧菌會引起對蝦的紅體病[7]；肺炎克雷伯菌是白鰱鰓絲、鰓耙潰爛病的致病菌，且該菌為強毒株等[8]。這些致病菌嚴重影響漁業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究對15種常見的水產(chǎn)動物致病菌的形態(tài)特征進行了染色鏡檢觀察，探討了其生長特性，以期為水產(chǎn)動物細菌性疾病的快速鑒定提供參考。

1材料與方法

1.1材料

無乳鏈球菌、溶壁微球菌和鮰愛德華氏菌3種細菌由中國科學院水生生物研究所李愛華研究員惠贈，遲鈍愛德華氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、枯草桿菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、河流弧菌、嗜水氣單胞菌B11、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌等購自上海北諾生物科技有限公司。

1.2方法

將金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、溶壁微球菌、遲鈍愛德華氏菌、副溶血弧菌、河流弧菌、表皮葡萄球菌、嗜水氣單胞菌B11、枯草桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、變形假單胞菌、熒光假單胞菌、鮰愛德華氏菌、腐敗希瓦桿菌等細菌的菌株在無菌的環(huán)境中分別接種到LB、TSA、sheih瓊脂平板上，在37℃或28℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)12～24h，觀察菌株的生長情況。

選取在37℃或28℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)12～24h后具有隆起、光滑、濕潤、圓形的菌落，用劃線的方式接種于LB、shieh或TSA瓊脂平板上，置 37℃或28℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)18～24h，保存在4℃的環(huán)境中備用。將所培養(yǎng)的細菌分別挑取單克隆進行革蘭氏染色后再鏡檢觀察其形態(tài)特征。

2結(jié)果與分析

金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、溶壁微球菌、枯草桿菌和表皮葡萄球菌均能在LB培養(yǎng)基上正常生長。金黃色葡萄球菌的菌落呈現(xiàn)金黃色，圓形、光滑、濕潤，針尖或米粒大；無乳鏈球菌在營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長緩慢，菌落較小，均為白色圓形、表面潤滑光滑、微隆起、邊緣整齊；表皮葡萄球菌的菌落呈現(xiàn)淡黃色，圓形、光滑，有點渾濁；溶壁微球菌、枯草桿菌、肺炎克雷伯菌、變形假單胞菌、DE3、腐敗希瓦桿菌的菌落圓形，表面光滑，微隆起(圖1)。

圖1　5種革蘭氏陽性致病菌在培養(yǎng)基上的生長形態(tài)

在LB培養(yǎng)基上能正常生長的革蘭氏陰性致病菌有肺炎克雷伯菌、河流弧菌、嗜水氣單胞菌B11、遲鈍愛德華氏菌、副溶血弧菌、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌。

鮰愛德華氏菌最佳的培養(yǎng)基TSA培養(yǎng)基，腐敗希瓦桿菌B16最佳的培養(yǎng)基為Shieh培養(yǎng)基。嗜水氣單胞菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形成邊緣整齊、表面濕潤、隆起、光滑、半透明、灰白色至淡黃色的圓形菌落；遲鈍愛德華氏菌在普通營養(yǎng)瓊脂上呈圓形光滑、較透明或半透明、邊緣整齊、無色或淺灰白色、稍隆起、直徑多在0.5mm(培養(yǎng)48h后多在1.2mm左右)；副溶血弧菌在濃度大的地方, 菌落邊緣不齊, 出現(xiàn)鋸齒狀, 單個菌落圓形、隆起, 表面光滑濕潤, 稍混濁不透明, 不產(chǎn)生色素；河流弧菌在LB 培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形，表面光滑、濕潤，邊緣不規(guī)則，質(zhì)地均勻，不透明，呈蠟樣；熒光假單胞菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長，菌落圓形、邊緣整齊、灰白色、半透明、濕潤，菌落直徑0.5～1.0mm，培養(yǎng)24h后開始產(chǎn)生綠色或黃綠色色素，彌漫培養(yǎng)基。大腸桿菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株生長 24h 后，形成直徑 2～3mm 邊緣整齊的菌落，菌落圓形、光滑、濕潤、半透明、灰白色、凸起；鮰愛德華氏菌是這些致病菌中較難培養(yǎng)的，在培養(yǎng)基平板上生長較緩慢，常需培養(yǎng)約48h才能形成直徑1～2mm、圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的無色小菌落(圖2)。

圖2　10種革蘭氏陰性致病菌生長狀態(tài)

由圖3可看出，金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、溶壁微球菌和枯草桿菌染色鏡檢時顏色為紫色，表明它們屬革蘭氏陽性菌。其中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌和溶壁微球菌的細菌形態(tài)均為球狀而枯草桿菌的形態(tài)為桿狀。

圖3　5種革蘭氏陽性致病菌鏡檢形態(tài)

由圖4可看出，嗜水氣單胞菌B11、鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、變形假單胞菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、副溶血弧菌和河流弧菌染色鏡檢時顏色為紅色，表明它們屬革蘭氏陰性菌。其中嗜水氣單胞菌B11、鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌的菌體兩端鈍圓,直形或略彎,革蘭氏陰性短桿菌,單個或成雙存在。而副溶血弧菌，河流弧菌革蘭氏陰性多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌，兩極濃染，無莢膜，無芽孢，有鞭毛。

圖4　10種革蘭氏陰性致病菌鏡檢形態(tài)

3討論

本研究對15種常見的水產(chǎn)動物致病菌進行平板培養(yǎng)和革蘭氏染色鏡檢觀察，對其生長特性和形態(tài)特征進行了研究，可為快速鑒定水產(chǎn)動物病原菌提供參考。朱芝秀等[9]從患病黃顙魚體分離出菌株，采用PCR方法檢測出致病性嗜水氣單胞菌為其致病菌。譚晶晶等[10]采取菌體形態(tài)觀察、生理生化鑒定及16S rRNA基因序列分析等方法從患病奧尼羅非魚中分離病原菌進行鑒定，結(jié)果表明，引發(fā)海南地區(qū)羅非魚暴發(fā)性鏈球菌病的主要病原是無乳鏈球菌。張芹等[11]利用生理生化的方法鑒定斑點叉尾鮰的致病

菌株，結(jié)果表明鮰愛德華氏菌是其致病菌。徐芊等[12]利用LAMP方法快速地檢測副溶血弧菌，結(jié)果表明該方法是檢測副溶血弧菌的有效手段。唐毅等[13]利用細菌生化鑒定了肺炎克雷伯菌，回歸感染試驗結(jié)果與自然感染發(fā)病的癥狀一致, 初步證實肺炎克雷伯氏菌為白鰱鰓絲、鰓耙潰爛病的致病菌，且該菌為強毒株。與上述鑒定致病菌的方法相比，本研究所用方法具有操作簡單、快速、成本低等特點，適用于廣大養(yǎng)殖戶對水產(chǎn)動物致病菌的快速識別，可為水產(chǎn)動物細菌性疾病診斷提供參考。

[參考文獻]

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[9]朱芝秀,鄧舜洲,楊竹青，等.致病性嗜水氣單胞菌PCR快速檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(12):40～44.

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[11]張芹,宋威,陳杰.斑點叉尾鮰鲇魚愛德華氏菌的分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(35):20121～20122.

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[13]唐毅,張芬,孫翰昌，等.白鰱肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].西南大學學報,2007,29(6):73～76.

[收稿日期]2015-08-06

[基金項目]長江大學濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金項目;湖北省新農(nóng)村發(fā)展研究院開放基金項目(2013CXJ08);湖北省公益性科研基金項目 (2012DBA29001)。

[作者簡介]徐佩(1989-)，女，碩士生，研究方向為魚類疾病。通信作者：許巧情，xuqiaoqing@yangtzeu.edu.cn。

[中圖分類號]S917.1；S941.42

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)09-0026-03

[引著格式]徐佩，艾克特，周靜文，等.15種水產(chǎn)動物致病菌生長特性及形態(tài)特征研究[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(9)：26～28,37.