王　芳，康　超，李永霞，賈　強，聶　飛

(貴州省生物研究所，貴州　貴陽　550009)

?

藍莓籽不同組分抗氧化作用的比較

王芳，康超，李永霞，賈強，聶飛

(貴州省生物研究所，貴州貴陽550009)

摘要：目的：為了加強藍莓籽的綜合利用開發(fā)，研究藍莓籽不同組分的抗氧化能力。方法：對藍莓籽的醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽蛋白、藍莓籽多糖進行提取分離，采用AAPH法、DPPH法對各組分進行抗氧化能力測定。結(jié)果：AAPH法測定的抗氧化能力由高到低的順序為：藍莓籽多糖﹥藍莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥藍莓籽多酚；DPPH法測定的清除自由基能力由高到低順序為：藍莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥藍莓籽蛋白﹥藍莓籽多糖。結(jié)論：藍莓籽不同組分均顯示出一定的抗氧化能力，其中以藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白的抗氧化能力最強，藍莓籽多酚的清除自由基能力最強。

關(guān)鍵詞：藍莓籽；藍莓籽多酚；藍莓籽多糖；藍莓籽蛋白；抗氧化

藍莓(blueberry)又稱越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬 (Vaccinium.spp ) ，其果實除含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類、碳水化合物、維生素以及微量元素等營養(yǎng)素，還富含花青素、鞣花酸和紫檀芪等生物活性物質(zhì)，具有改善視力、預(yù)防心腦血管疾病、降血壓、 降血脂、消炎、預(yù)防和治療癌癥、改善大腦活力、強抗氧化性和自由基清除能力等作用，被世界衛(wèi)生組織認為是抗氧化性最強的水果之一[1-3]。近幾年，隨著公眾對藍莓營養(yǎng)保健功能的關(guān)注，藍莓產(chǎn)品的需求越來越大。

本文以現(xiàn)代生物活性物質(zhì)分離技術(shù)，提取、分離和制備藍莓籽醇提取物、多酚、多糖、粗蛋白等不同組分，并對不同組分進行抗氧化活性比較，為藍莓籽的綜合開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

藍莓籽：新鮮藍莓采自貴州省麻江縣藍莓果園，經(jīng)發(fā)酵釀酒后取果糟渣干燥粉碎，初篩后得到藍莓籽，再將藍莓籽粉碎過100目篩，于-20 ℃凍藏備用；DPPH、AAPH(日本和光純藥工業(yè)株式會社，分析純)，亞油酸(SigmaAldrich公司，分析純)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HH—6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；HR2839攪拌機，珠海飛利浦家庭電器有限公司；WGT型數(shù)控超聲波清洗器，深圳市威固特超聲儀器有限公司；AF—610A原子熒光光譜儀，北京瑞利分析儀器有限公司；小分子透析袋，分裝，進口。

1.3試驗方法

1.3.1藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖的制備

稱取藍莓籽粉100 g，加入9倍體積60 %乙醇水浴浸提3 h，重復(fù)兩次；將醇溶性成分真空濃縮，其中一半干燥后得到藍莓籽醇提物；另一半用等體積乙酸乙酯提取，乙酸乙酯層濃縮后干燥得藍莓籽多酚，水層經(jīng)三氯乙酸脫蛋白，加入3倍體積95 %乙醇沉淀，沉淀溶解后透析，干燥得到藍莓籽多糖。

1.3.2藍莓籽蛋白的制備

稱取藍莓籽粉100 g，加入40 %乙醇浸提半小時，重復(fù)三次，過濾；殘渣加入0.05M Tris—HCI緩沖液，常溫磁力攪拌16 h；過濾后溶液用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，然后加硫酸銨至50 %飽和度沉淀蛋白，再用0.05 M Tris—HCI緩沖液溶解沉淀，透析后得到藍莓籽粗蛋白。

1.3.3藍莓籽多酚、多糖、蛋白質(zhì)含量的測定

藍莓籽多酚含量用酒石酸鐵比色法(GB8313—87)測定。藍莓籽提取物中的多糖含量測定按照硫酸-苯酚法測定[4]，以葡萄糖作為標準。藍莓籽提取物中的蛋白質(zhì)含量按照Lowry—Folin法測定[5]。

1.3.4藍莓籽不同組分抗氧化活性的測定

1.3.4.1AAPH法

參考文獻[6]，分別將提取的藍莓籽多酚、藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白和醇提取物制成濃度為25 μg / ml的溶液。取1 ml待測樣品溶液于10 ml的具塞試管中，加入2 ml 2.51 %(W / V)的亞油酸無水乙醇溶液，4 ml 0.05 mol / L pH7.0的磷酸鹽緩沖液，2 ml蒸餾水，超聲波混勻。加入0.417 ml的0.1M AAPH，密閉后放在暗處并于37 ℃恒溫水浴鍋中保持200 min。按照硫氰酸鐵法(FTC法)測定氧化程度；取0.1 ml該混合溶液，加入9.7 ml 75 %乙醇和0.1 ml 30 %硫氰酸銨，再加入0.1 ml 0.02 mol / L溶解于3.5 %鹽酸中的氯化亞鐵，混勻。反應(yīng) 5 min后，在500 nm測定吸光度，再在 50 min、100 min 、200 min時各測定一次。空白不加抗氧化劑，相同濃度的α—VC(25 μg / ml)作為陽性對照。所有結(jié)果均為試驗三次的平均值。

1.3.4.2DPPH法

參考文獻[7]，DPPH用無水乙醇配成2×10-4M的溶液，置于4 ℃避光保存。藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白和陽性對照品均用無水乙醇配成1 mg / ml的原液。吸取供試原液各100 μL，并分別加入了2×10-4M DPPH的溶液100 μL，然后放入96孔板的各孔中，同時以不加DPPH(以100 μL無水乙醇代替DPPH)的供試品溶液濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結(jié)果的干擾，并設(shè)DPPH陰性對照(以100 μL無水乙醇代替供試品)，每組平行設(shè)4個復(fù)孔。將96孔板放入酶標儀中，震蕩1 min，并于此條件下保存(室溫、避光)，30 min后測定其在517 nm處的吸光度OD值，按如下公式計算供試品的自由基清除率。以樣品濃度對清除率作圖，求出清除率50 %時所需樣品濃度，即為半清除濃度EC50。

自由基清除率=[ODDPPH· control—(ODsamp—le—ODsample control)]/ ODDPPH· control×100 %

其中：ODDPPH· control為DPPH陰性對照組OD值的平均值；

ODsample為樣品組OD值的平均值；

ODsample control為樣品乙醇對照組OD值的平均值。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(n=3)，平均值之間的差異顯著性采用SPSS 8.0的LSD檢驗法進行統(tǒng)計分析，若P﹤0.05，則認為差異顯著；圖表采用Excel2007制作。

2結(jié)果與分析

2.1藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖和藍莓籽蛋白含量測定結(jié)果

如表1所示，藍莓籽醇提取物中藍莓籽多酚、多糖、蛋白的含量分別為382.6±3.8 g / kg、187.1±26.5 g / kg、347.2±9.6 g / kg；按方法1.3.1提取藍莓籽多酚其多酚類物質(zhì)含量為843.6±9.8 g / kg，多糖、蛋白類物質(zhì)未檢出；按方法1.3.1提取的藍莓籽多糖其糖類物質(zhì)含量為403.3±6.1 g / kg，蛋白類物質(zhì)的含量為32.9±3.7 g / kg，蛋白類比重低于10 %，可忽略不計，多酚類物質(zhì)未檢出；按方法1.3.2提取的藍莓籽蛋白其蛋白類物質(zhì)含量為521.6±16.9 g / kg，多酚類、糖類物質(zhì)未檢出。

表1　藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽

注： ND表示未檢測出。

2.2藍莓籽不同組分抗氧化活性

2.2.1AAPH法測定藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白的抗氧化活性

AAPH法測定了藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白對亞油酸過氧化反應(yīng)的抗氧化能力。如圖1所示，藍莓籽不同組分均有一定的抗氧化作用，在200 min反應(yīng)時間內(nèi)，隨時間的延長各組分的抗氧化能力呈下降趨勢，其中藍莓籽多糖顯示出最高的抗氧化能力。抗氧化能力由高到低的順序為：藍莓籽多糖﹥藍莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥藍莓籽多酚。

圖1　藍莓籽提取物AAPH法抗氧化能力曲線圖

2.2.2DPPH法測定藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白的抗氧化活性

1)DPPH自由基廣泛應(yīng)用于評價活性物質(zhì)清除自由基活性的試驗中。藍莓籽藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白都對DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著活性物質(zhì)濃度的增加，清除率也相應(yīng)增加。

DPPH法測定了藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽多糖、藍莓籽蛋白清除自由基活性。如圖2所示，顯示藍莓籽不同組分清除DPPH自由基的動態(tài)變化曲線以及清除效果，表示藍莓籽不同組分均有一定的抗氧化能力。其清除自由基能力由高到低順序為：藍莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥藍莓籽蛋白﹥藍莓籽多糖。前5 min之內(nèi)，各組分清除能力最強，吸光值急劇下降，特別是藍莓籽多酚表現(xiàn)出比陽性對照α—VC還要強的清除DPPH自由基的能力。

圖2　藍莓籽提取物DPPH法抗氧化能力曲線圖

2)根據(jù)2.2.2測定結(jié)果，進一步設(shè)計并配制五個不同濃度的樣品溶液，同時以天然抗氧化劑α—VC為陽性對照，通過濃度—效應(yīng)關(guān)系計算EC50值，如表2所示。

表2　藍莓籽提取物EC50值

3結(jié)論與討論

藍莓籽的構(gòu)成成分主要有藍莓籽多酚(主要是兒藍莓籽素類、黃酮類)、藍莓籽蛋白、藍莓籽多糖等。采用兩種方法對藍莓籽醇提取物、藍莓籽多酚、藍莓籽蛋白、藍莓籽多糖進行抗氧化能力測定，其中AAPH法測定的抗氧化能力由高到低的順序為：藍莓籽多糖﹥藍莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥藍莓籽多酚；DPPH法測定的清除自由基能力由高到低順序為：藍莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥藍莓籽蛋白﹥藍莓籽多糖。從測定結(jié)果可見，藍莓籽不同組分均有一定的抗氧化能力，其中藍莓籽多糖的抗氧化能力與對照相比有顯著性差異，表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。同時，藍莓籽多酚清除自由基能力有顯著性差異，清除自由基能力較強。

屈小媛等[8]對藍莓籽油揮發(fā)性成分的GC—MS分析結(jié)果表明，其優(yōu)勢成分主要有姜黃烯、α—長葉蒎烯、異石竹烯、異戊酸L—薄荷酯、亞麻醇、植物類谷甾醇、苯乙醇、L—抗壞血酸—2，6—二棕櫚酸酯、亞油酸乙酯、角鯊烯等活性成分，具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗衰老、降低膽固醇和血脂等作用。

本文通過抗氧化試驗表明藍莓籽多糖和藍莓籽蛋白具有較強的抗氧化能力，藍莓籽多酚清除自由基能力顯著，藍莓籽具有開發(fā)利用價值和前景。

參考文獻【REFERENCES】

[1]韓鵬祥，張蓓，馮敘橋，等.藍莓的營養(yǎng)保健功能及其開發(fā)利用[J].食品工業(yè)科技，2015，36(6)：370—379.

HAN P X，ZHANG B，F(xiàn)ENG X Q， et al.Nutritional and health functions of blueberry and its development and utilization[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry，2015， 36(6)：370—379.

[2]陳美珺，梁統(tǒng)，周克元.原花青素的抗炎作用及其作用機制探討[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，29(12)：1080—1082.

CHEN M J，LIANG T，ZHOU K Y.Study on the anti—inflammatory effect of proanthocyanidins and its mechanism[J].IntLabMed，2008，29(12)：1080—1087.

[3]Fernandes I，Marques F，F(xiàn)reitas V D，et al.Antioxidant and antiproliferative properties of methylated metabolites of anthocyanins[J].Food Chemistry，2013，141(3)：2923—2933.

[4]宋李桃，劉貴先，林洲，等.不同產(chǎn)地太子參多糖含量測定和對小鼠抗應(yīng)激作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014(3)25—27.

SONG L T，LIU G X，LIN Z，et al.Experimental study on anti—stress function and content determinationof radix pseudostellariae from different habitats[J].JournalofLiaoninguniversityofTCM，2014(3)25—27.

[5]Lowry O H，Rosebrough N J，F(xiàn)arr A L，Randall R J，et al.福林酚試劑法測定蛋白質(zhì)[J].陳祥娥 編譯.食品與藥品，2011，13(3)：147—151.

Lowry O H，Rosebrouhg N J，F(xiàn)arr A L，Randall R J，et al.Protein measurement with folin’s phenol reagent.J.Bio.Chem.1951，193，265-275.

[6]Hu C，Kitts D D.Evaluation of antioxidant activity of epigallocatechin gallate in biphasic model systems in vitro[J].MolecularandCellularBiochemistry，2001，218(1)：147—155.

[7]Lin M Y，Chang F J.Antioxidative effect of intestinal bacteria bifidobacterium Longum ATCC 15708 and Lactobacillus Acidophilus ATCC 4356[J].DigestiveDiseasesandSciences，2000，45(8)：1617—1622.

[8]屈小媛，楊毓銀，謝小林，聶飛，吳世根，李永霞，賈強.藍莓籽油揮發(fā)性成分的GC—MS分析[J].中國調(diào)味品，2014，39(6)：124—127.

QU X Y，YANG Y Y，XIE X L et al.Analysis of volatile constituents in blueberry seed oils by GC—MS[J].ChinaCondiment，39(6)：124—127.

投稿日期：2016-01-17；修回日期：2016-01-20

Comparison of antioxidant activities of different components in blueberry seeds

WANG Fang，KANG Chao，LI Yongxia，JIA Qiang，NIE Fei

(GuizhouInstituteofBiology，Guiyang550009，China)

Abstract：Objective：In order to strengthen the comprehensive utilization of blueberry seeds，the antioxidant capacities of different components in blueberry seeds were studied.The methods are：extract and separate alcohol extraction，polyphenols，protein and polysaccharide from blueberry seeds.And then，the antioxidant capacities of different components above were determined by AAPH and DPPH.The results are that the antioxidant capacities determined by AAPH from high to low order are：blueberry seed polysaccharide﹥blueberry seed protein≈α—VC﹥alcohol extraction﹥blueberry seed polyphenols.The antioxidant capacities determined by DPPH from high to low order were：blueberry seed polyphenols﹥alcohol extraction≈α—VC﹥blueberry seed protein﹥blueberry seed polysaccharide.The results show that different components in blueberry seeds occur in certain antioxidant capacities，blueberry seed polysaccharide and blueberry seed protein which has strongest antioxidant activities，and strongest activities in scavenging free radicals.

Keywords：blueberry seeds；blueberry seed polyphenols；blueberry seed polysaccharide；blueberry seed protein；antioxidant

中圖分類號：TS 207.3

文獻標識碼：A

文章編號：1003—6563(2016)02—0015—04

*基金項目：貴州省重大專項“山地藍莓產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”(黔科合重大專項字[2015]6013號)；貴州科學(xué)院2013年基金項目“藍莓貯藏期灰霉病拮抗菌株的篩選和生物學(xué)特性研究”。

作者簡介：王芳(1983-)，女，碩士，助理研究員。研究方向：生物資源開發(fā)利用。

通訊作者：▲聶飛(1965-)，男，碩士，研究員。研究方向：藍莓繁育與栽培技術(shù)研究。