姜其鈞，龔志剛，李志剛，丁世芳

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乙醛脫氫酶2調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞氧化應激反應的機制

姜其鈞，龔志剛，李志剛，丁世芳

摘要

目的：探討乙醛脫氫酶2（ ALDH-2）在內(nèi)皮祖細胞（EPCs） 的氧化應激反應中的調(diào)節(jié)作用和機制。

方法：培養(yǎng)人外周血EPCs，分別用空白對照、1 μmol/L ALDH-2特異性激活劑 （Alda-1）、1 μmol/L叔丁基過氧化氫（tBHP）和1 μmol/L Alda-1預處理+1 μmol/L tBHP干預，再分別用2'，7'-Dichlorofluorescein diacetate （DCFH-DA）和5，5'，6，6'-Tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide（JC-1）染色EPCs，檢測EPCs的自由氧水平和線粒體膜電位，采用Transwell小室評價EPCs的遷移能力，采用蛋白免疫印跡（Western blot）評價EPCs的p38信號通路激活情況。

結果：tBHP干預和Alda-1預處理+ tBHP干預后的自由氧水平相對于空白對照分別為（441.7±24.8）%和（237.4±12.0）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。空白對照、tBHP干預和Alda-1預處理+ tBHP干預的EPCs發(fā)生線粒體膜電位丟失的細胞比率分別為（5.7±2.1）%，（81.7±3.7）%和（37.4±3.2）%；EPCs的遷移細胞數(shù)分別為108±9/高倍視野，22±4/高倍視野和67±7/高倍視野，三者間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加入tBHP后EPCs 的p38信號通路增強［信號強度為空白對照的（259.1±7.7）%］，激活ALDH-2后，tBHP引起的p38信號活動被減弱［為空白對照的（186.4±8.0）%］。

結論：ALDH-2能夠減少EPCs氧化應激反應，減少EPCs線粒體膜損傷，保護EPCs的遷移功能。而這可能與p38信號通路有關。

關鍵詞內(nèi)皮祖細胞；乙醛脫氫酶2；氧化應激；線粒體膜電位

作者單位：430070湖北省武漢市，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心血管內(nèi)科

（Chinese Circulation Journal，2016，31：502.）

內(nèi)皮祖細胞（EPCs）是成人最重要的調(diào)節(jié)血管新生和形成血管內(nèi)皮的一組干細胞。它在冠心病患者血管內(nèi)皮細胞修復中起關鍵作用。既往的研究表明EPCs具有較強的抗氧化能力，能夠避免氧化應激導致的損傷。而最近的研究表明，在急性心肌梗死等嚴重狀態(tài)下，EPCs的氧化應激顯著增加，凋亡率顯著增加［1］，其機制還不十分明確。乙醛脫氫酶2 （ALDH-2）是機體醛類代謝中的關鍵限速酶，被認為能夠起到明顯抗氧化的作用。而最近的研究發(fā)現(xiàn)ALDH-2在EPCs是普遍高表達［2］，但其在EPCs功能調(diào)節(jié)和抗氧化中的作用卻未被全面了解。而本文的研究重點是探討ALDH-2在EPCs的氧化應激調(diào)節(jié)中的作用及其分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

硫氰酸熒光素標記荊豆凝集素-I（FITCUEA-I）、0.25%的胰酶、叔丁基過氧化氫（tBHP，模擬氧化應激損傷的常用試劑，化學性質(zhì)與過氧化氫（H2O2）相似，但更穩(wěn)定，不易降解）、ALDH-2特異性激活劑Alda-1、2'，7'-Dichlorofluorescein diacetate （DCHF-DA）和5，5'，6，6'-Tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide（JC-1）均購自美國Sigma公司；Histopaque1077淋巴細胞分離液購自美國Amersham Biosciences公司；血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF），成纖維細胞生長因子（bFGF）購于英國Peprotech公司；乙?；兔芏戎鞍祝―il-Ac-LDL）購自美國Molecular Probe公司；M199培養(yǎng)液，胎牛血清 （FBS）購于美國Gibco公司；24孔Transwell小室購自美國Millipore公司。

1.2 內(nèi)皮祖細胞的分離與培養(yǎng)

采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，加入VEGF、bFGF體外誘導培養(yǎng)EPCs［3］。本實驗取健康志愿者外周血，以1∶2比例磷酸鹽緩沖液（1×PBS緩沖液，pH7.4）稀釋后，緩慢移至Histopaque 1077淋巴細胞分離液上方，400×g室溫離心30 min，分離出中間單個核細胞層。將分離好的單核細胞用含有10%FBS、20%FBS、VEGF10 ng/ ml、bFGF 10 ng/ml的M199培養(yǎng)液稀釋成5×106/ ml，放置于37℃，5%二氧化碳（CO2）孵箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)到第4天，用1×PBS洗去非貼壁細胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；取第7天的細胞，加入2.4 mg/L DiIAc-LDL和10 mg/L FITC-UEA-I于37℃孵育1 h后，用熒光顯微鏡檢測雙染色陽性細胞百分比。另取第7天的細胞，用0.25%胰酶消化，分別加入10 mg/L藻紅蛋白（PE）標記的血管內(nèi)皮生長因子受體2 （VEGF-R2）單克隆抗體、10 mg/L FITC標記的CD34抗體，4℃孵育30 min后，上流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達率。于第7天，加入無血清的培養(yǎng)液同步化細胞24 h，進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞內(nèi)自由氧水平測定

采用DCFH-DA檢測細胞內(nèi)自由氧水平［4］。DCHF-DA是一種通透性很強的小分子，能夠迅速進入細胞內(nèi)，與自由氧結合后在激發(fā)光源的作用下呈綠色熒光，是一種很好的細胞內(nèi)自由氧的標記物質(zhì)。培養(yǎng)至第8天的EPCs培養(yǎng)基中分為空白對照、及分別加入1 μmol/L Alda-1、1 μmol/L tBHP、1 μmol/L Alda-1預處理30 min+1 μmol/L tBHP，干預6 h后，采用1×PBS清洗2次，采用10 μmol/L DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗3次以去除探針，采用熒光顯微鏡（激發(fā)波長488 nm）拍照檢測綠色熒光強度，Image-proplus6.0軟件分析熒光強度。DCF相對熒光強度（%）=處理組的熒光值/對照組的熒光值×100%。

1.4 細胞線粒體膜電位的檢測

采用JC-1檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位［5］。JC-1因濃度不同以不同形態(tài)存在，發(fā)射光譜各異，低濃度時為單體，呈綠色熒光，高濃度時為多聚體，呈現(xiàn)紅色熒光。在正常細胞內(nèi)，JC-1被迅速攝入細胞線粒體內(nèi)，形成多聚體，呈現(xiàn)紅色熒光或紅綠混合的黃色；在線粒體膜通透性發(fā)生改變時，由于線粒體膜電位去極化，線粒體內(nèi)釋放JC-1，多聚體分解，紅光強度減弱，胞質(zhì)內(nèi)JC-1逐漸以單體形式存在并呈綠色熒光。培養(yǎng)至第8天的EPCs培養(yǎng)基中分為空白對照、及分別加入1 μmol/L Alda-1、1 μmol/L tBHP、1 μmol/L Alda-1預處理30 min+1 μmol/L tBHP，干預24 h后，除去培養(yǎng)基，1×PBS洗2次，滴加JC-1工作液100 μl，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)20 min，1×Incubation Buffer洗2次，于熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)膜電位丟失細胞比例。

1.5 內(nèi)皮祖細胞遷移能力檢測

采用Transwell小室評價EPCs的遷移能力［6］。選中間濾膜孔徑為8 μm的Transwell小室，將EPCs加入上室，下室加入含VEGF的培養(yǎng)液，通過計算遷移入下室的EPCs數(shù)量評價EPCs的遷移能力。本實驗將同步化后的EPCs用0.25%胰酶消化，用無血清的M199培養(yǎng)基重懸后，以2×104/孔的密度重新種植于24孔板Transwell的上室，下室加入含50 μg/L VEGF的培養(yǎng)基，1 h后分為空白對照、及分別加入1 μmol/L Alda-1、1 μmol/L tBHP、1 μmol/L Alda-1預處理30 min+1 μmol/L tBHP，干預30 min后，CO2孵箱孵育24 h，4%的多聚甲醛固定30 min，棉簽擦去膜上側(cè)的細胞，結晶紫染色3 min，清水洗去結晶紫，在高倍光學顯微鏡（×100）下計數(shù)6個隨機視野的EPCs數(shù)量。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測

將藥物干預結束之后的EPCs加入蛋白提取裂解液，于4℃裂解細胞30 min，4℃ 8000×g離心30 min，去除沉淀，加入上樣緩沖液后煮沸10 min，于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，5%的無脂牛奶封閉1 h，分別給予鼠抗人磷酸化p38 IgG抗體和鼠抗人p38 IgG抗體，4℃孵育12 h，1×TBST（pH值7.4）洗3次，羊抗鼠二抗室溫下孵育1 h，電化學發(fā)光（ECL）顯影，Image-proplus6.0軟件分析信號強度。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 內(nèi)皮祖細胞的形態(tài)與鑒定

EPCs體外培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)集落，4天后多數(shù)集落已經(jīng)形成，于第8天后加入DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色，其中90%細胞吞噬DiI-Ac-LDL（熒光顯微鏡下呈紅色），及FITC-UEA-I（熒光顯微鏡下呈綠色）染色陽性，見圖1。采用FITC標記的鼠抗人CD34以及PE標記的鼠抗人VEGF-R2抗體于流式細胞儀檢測細胞表面標志，CD34及VEGF-R 2陽性率分別達到80%以上細胞進行后續(xù)實驗。

圖1　內(nèi)皮祖細胞的形態(tài)和熒光顯微鏡圖

2.2 乙醛脫氫酶2調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞的自由氧水平（圖2）

結果顯示相對于空白對照加入tBHP和Alda-1+tBHP后的熒光強度分別為（441.7±24.8）%和（237.4±12.0）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3乙醛脫氫酶2穩(wěn)定內(nèi)皮祖細胞的線粒體膜電位（圖3）

結果顯示空白對照、加入tBHP和加入Alda-1+tBHP膜電位丟失EPCs的比率分別為（5.7±2.1）%，（81.7±3.7）%和（37.4±3.2）%，三者間差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 乙醛脫氫酶2保護內(nèi)皮祖細胞的遷移能力（圖4）

結果顯示空白對照、加入tBHP和Alda-1 +tBHP下室EPCs的數(shù)量分別為108±9/高倍視野、22±4/高倍視野和67±7/高倍視野，三者間差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 p38信號通路的作用

Western blot法檢測結果示：相對于空白對照，加入tBHP后p38信號通路增強［信號強度為空白對照的（259.1±7.7）%］，而激活ALDH-2后，tBHP引起的p38信號活動被減弱［信號強度為空白對照的（186.4±8.0）%］。

圖2　DCHF-DA染色顯示乙醛脫氫酶2調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞的自由氧水平

圖3　JC-1染色顯示乙醛脫氫酶2能夠穩(wěn)定內(nèi)皮祖細胞的線粒體膜電位

圖4　Transwell小室實驗顯示乙醛脫氫酶2保護內(nèi)皮祖細胞的遷移能力

3 討論

EPCs在缺血組織的血管新生和損傷血管的再內(nèi)皮化中發(fā)揮著至關重要的作用［7］。EPCs的功能與其抗氧化能力是密不可分的［8］。氧化應激嚴重影響了EPCs的數(shù)量和功能，導致內(nèi)皮功能紊亂，與心血管疾病的發(fā)病機制密切相關［9］。EPCs的再生能力部分要歸功于它們高表達抗氧化蛋白、產(chǎn)生的自由氧水平低以及對自由氧誘導的細胞凋亡的敏感性降低。既往的研究發(fā)現(xiàn)EPCs中同時存在超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶等重要抗氧化酶［10］，但EPCs中的各種抗氧化酶的地位仍未被完全研究清楚。既往的研究發(fā)現(xiàn)分別抑制上述三種酶都不足以升高EPCs的自由氧水平，只有聯(lián)合抑制這3種抗氧化酶才能顯著增加EPCs的自由氧水平，削弱其存活和遷移能力。但是在同樣的條件下，聯(lián)合抑制EPCs這3種抗氧化酶后產(chǎn)生的自由氧水平仍然較人臍靜脈內(nèi)皮細胞低［11］，提示還有另外的抗氧化酶在EPCs中發(fā)揮清除自由氧的作用。

本研究采用DCHF-DA評價氧化應激水平，采用JC-1評價EPCs線粒體膜電位情況。DCHF-DA是一種通透性很強的小分子，能夠迅速進入細胞內(nèi)，與自由氧結合后在激發(fā)光源的作用下呈綠色熒光，是一種很好的細胞內(nèi)自由氧的標記物質(zhì)。而JC-1常被用來評價細胞線粒體膜電位。JC-1因濃度不同以不同形態(tài)存在，發(fā)射光譜各異，低濃度時為單體，呈綠色熒光，高濃度時為多聚體，呈現(xiàn)紅色熒光。在正常細胞內(nèi)，JC-1被迅速攝入細胞線粒體內(nèi)，形成多聚體，呈現(xiàn)紅色熒光或紅綠混合的黃色；在線粒體膜通透性發(fā)生改變時，由于線粒體膜電位去極化，線粒體內(nèi)釋放JC-1，多聚體分解，紅光強度減弱，胞質(zhì)內(nèi)JC-1逐漸以單體形式存在并呈綠色熒光。tBHP是一種氧化劑，能夠生成自由氧，具有很強的細胞毒性效應。Alda-1是一種小分子物質(zhì)，可顯著增強ALDH-2酶活性，目前被作為ALDH-2的外源性激活劑應用在動物和細胞實驗中。我們前期的研究表明1 μmol/L tBHP可引起EPCs氧化應激，誘導EPCs凋亡［5］。本研究顯示，tBHP刺激EPCs后，能引起EPCs 內(nèi) DCHF-DA的綠色熒光增強，JC-1的熒光由黃色轉(zhuǎn)化為綠色，遷移能力明顯降低，而激活ALDH-2后，再加入tBHP，EPCs內(nèi) DCHF-DA的熒光強度和JC-1的熒光轉(zhuǎn)化現(xiàn)象均弱于未激活ALDH-2的時候，遷移能力明顯恢復。Western blot實驗還發(fā)現(xiàn)tBHP干預后，EPCs的p38信號增強，而預激活ALDH-2后，再加入tBHP，EPCs的p38的信號強度要弱于未預激活ALDH-2時。這說明，tBHP能引起EPCs的氧化應激反應、線粒體膜電位降低和遷移能力降低，而激活ALDH-2能夠促進EPCs內(nèi)的抗氧化機制，減少tBHP對EPCs的傷害，可能與p38信號通路有關。

ALDH-2可以通過保護機體對抗氧化應激損傷，抑制自由氧相關毒性產(chǎn)物的生成，從而起到抑制細胞凋亡發(fā)生的作用。既往的研究表明ALDH-2活性與應激對細胞造成的損傷程度密切相關；ALDH-2基因缺失型小鼠遭受到氧化應激損傷的概率較正常小鼠顯著升高，且轉(zhuǎn)染ALDH-2缺失型基因后細胞更易遭受四羥基壬烯醛（4-HNE）和氧化應激損傷［12］；提高ALDH-2活性可拮抗氧化產(chǎn)物和缺血再灌注對細胞造成的損傷，然而，轉(zhuǎn)染野生型ALDH-2基因能明顯抑制細胞內(nèi)的自由氧的生成［13］。這些結果表明ALDH-2可能是組織或細胞拮抗氧化應激損傷的重要保護因子。

ALDH-2主要通過對抗氧化應激造成的線粒體損傷起到抗氧化作用，對維持線粒體的正常功能發(fā)揮重要作用［14］。生理水平下的自由氧對轉(zhuǎn)錄因子激活、調(diào)節(jié)細胞功能、增殖和分化等方面具有重要意義，但過量的自由氧可導致細胞功能障礙，引起凋亡［15］。正常情況下，EPCs存在抗氧化酶系統(tǒng)，但是當細胞正常的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡時，自由氧過度產(chǎn)生而聚積，引起氧化應激，使DNA、蛋白質(zhì)和碳水化合物被氧化，引起蛋白質(zhì)的氧化損傷和DNA突變，同時自由氧還可與細胞膜和線粒體膜上脂質(zhì)相互作用，產(chǎn)生4-HNE、丙二醛（MDA）等醛類物質(zhì)，增加膜通透性，破壞其完整性，導致細胞損傷、衰老和凋亡。線粒體是細胞中自由氧的主要來源［16］。ALDH-2是線粒體內(nèi)的重要的醛類氧化酶，具有脫氫酶和酯酶等多種酶功能，不僅在乙醛代謝中起重要作用，還可以氧化MDA和4-HNE等氧化產(chǎn)物，發(fā)揮間接抗氧化作用，使其轉(zhuǎn)化為無毒性的相應酸，從而對抗醛類和自由氧對細胞造成的損傷作用。因此ALDH-2失活可導致醛類物質(zhì)和自由氧堆積，對機體組織、器官等造成不可逆性損傷。

綜上分析，ALDH-2可能通過清除EPCs內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，減少EPCs內(nèi)自由氧水平，抑制氧化應激相關信號通路的激活，保護線粒體膜電位，改善EPCs的功能，減少其凋亡。本研究為后續(xù)研究提高EPCs在缺血或缺血再灌注等高氧化應激環(huán)境中存活率的方法提供基礎。

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（編輯：常文靜）

病例報告

Mechanism of Aldehyde Dehydrogenase-2 Regulated Human Endothelial Progenitor Cells Oxidative Stress Reaction

JIANG Qi-jun，GONG Zhi-gang，LI Zhi-gang，DING Shi-fang.
Department of Cardiology，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military，Wuhan （430070），Hubei，China

Abstract

Objective：To investigate the role of aldehyde dehydrogenase-2 （ALDH-2） for regulating human endothelial progenitor cells （EPCs） oxidative stress reaction and its mechanism.

Methods：Human EPCs were isolated from peripheral blood of healthy adults and the cells were cultured in 4 groups：①Blank control group，②Alda-1 group，the cells were treated by 1μmol/L Alda-1，a specific activator of ALDH-2，③tBHP （10μg/ml） group and④Alda-1 pretreatment+tBHP group.EPCs reactive oxygen species （ROS） levels were evaluated by DCFH-DA staining，mitochondrial membrane potentials were detected by JC-1 method，migration capacity was measured by transwell chamber method and the activation of p38 signal pathway was examined by Western blot analysis.

Results：Compared with Blank control group，ROS levels in tBHP group and Alda-1 pretreatment+tBHP group were （441.7 ± 24.8） % and （237.4 ± 12.0） %，all P＜0.05.In Blank control group，tBHP group and Alda-1 pretreatment+tBHP group，the proportion of EPCs lost their mitochondrial membrane potentials were （5.7 ± 2.1） %，（81.7 ± 3.7） % and （37.4 ± 3.2） % respectively，all P＜0.05； the number of EPCs migration were （108 ± 9）/HP，（22 ± 4）/HP and （67 ± 7）/HP respectively，all P＜0.05.Compared with Blank control group，the activation of p38 signal pathway increased to （259.1 ± 7.7） % in tBHP group，while it was reduced to （186.4 ± 8.0） % in Alda-1 pretreatment+tBHP group.

Conclusion：ALDH-2 could reduce ROS level in human EPCs，it may decrease mitochondrial membrane damage，protect migration which might be related to p38 signal pathway.

Key wordsEndothelial progenitor cells； Aldehyde dehydrogenase-2； Oxidative stress； Mitochondrial membrane potentials

基金項目：湖北省自然科學基金面上資助項目（2014CFC1055）

作者簡介：姜其鈞主治醫(yī)師博士主要研究方向為冠心病的干細胞治療Email：jqjraymond@qq.com通訊作者：丁世芳Email：DingSFMD@gmail.com

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）05-0502-06

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.05.020

Corresponding Author：DING Shi-fang，Email：DingSFMD@gmail.com

收稿日期：（2015-11-13）