袁思明,房麗麗,何　德,李翠新

(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,云南 昆明 650224)

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一株野生香菇的鑒定及菌絲最佳生長條件研究

袁思明,房麗麗,何德*,李翠新*

(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,云南 昆明 650224)

摘要：為了對(duì)采集的一株野生香菇進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，實(shí)驗(yàn)采取了rDNA ITS序列分析以及形態(tài)鑒定的方法，研究結(jié)果表明該菌株就是香菇.實(shí)驗(yàn)對(duì)其菌絲的最佳生長條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其菌絲生長的最適碳源為麥芽糖，最適氮源為牛肉膏，最適碳氮比為30∶1，最適pH為5～6，硫酸鎂能夠促進(jìn)菌絲的生長.

關(guān)鍵詞：香菇；鑒定；碳源；氮源

圖1　采自云縣的野生香菇Fig.1　The wild Lentinula edodes collected from Yunxian

香菇(Lentinulaedodes)又名香菌俗稱中國蘑菇，被人們譽(yù)為“菇中皇后”[1]，是馳名中外的食用菌和藥用菌，其人工栽培僅次于雙孢菇[2].香菇清香可口，別有風(fēng)味，深受人們的喜愛.香菇不僅含有豐富的維生素和氨基酸，而且還具有良好的保健功能，如抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、降血脂、抗血栓、保肝[3]、健胃、預(yù)防佝僂病和預(yù)防現(xiàn)代“文明病”[4]等.野生香菇主要分布在華南、華中、西南地區(qū)，人工栽培遍布全國[5].野生香菇除了具有濃郁的香味和脆嫩的質(zhì)地，還具有很強(qiáng)的抗逆性，因此可以作為培養(yǎng)香菇優(yōu)良品種的雜交親本[6],合理開發(fā)和利用這些資源將是提高香菇育種水平的前提和保障，因此分離、保藏野生香菇菌株具有十分重要的意義[7-10].云南省地處低緯，干濕分明，氣候宜人，為野生食用菌的生長提供了優(yōu)質(zhì)的氣候環(huán)境[11]，該地區(qū)的野生香菇資源豐富，香味濃郁，深受消費(fèi)者喜歡.因此本文將研究野生香菇菌絲體的生物學(xué)特性，以期為香菇的生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究提供依據(jù).

1材料和方法

1.1供試菌種

對(duì)2014年5月采自云南省云縣的野生香菇(如圖1所示)的一株進(jìn)行了菌種分離培養(yǎng).

1.2香菇的DNA提取及ITS分子鑒定

1.2.1基因組DNA的提取將分離得到的野生香菇菌種接到PDA斜面培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)7～10 d，然后接種于液體培養(yǎng)基中，室溫靜置培養(yǎng)一個(gè)月后用濾紙收集香菇的菌絲體，吸水紙吸干.取適量菌絲體用液氮充分研磨后快速盛入1.5 ml的Eppendorf管中，加入750 μL的預(yù)熱CTAB(2%)提取緩沖液，振蕩混勻后加入5 μL的β-巰基乙醇，65℃水浴1 h后12 000 r/min離心20 min.取上清液加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為25∶24∶1)充分混勻，慢慢搖晃1 h后12 000 r/min離心20 min.取上清液轉(zhuǎn)管至新的1.5 mL的Eppendorf管中，加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶1)慢慢搖晃1 h后12 000 r/min離心20 min.取上清液轉(zhuǎn)管，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇置于-20℃冰箱30 min，8 000 r/min離心5 min.棄上清液，沉淀用75%的乙醇洗滌2～3次，晾干加入30 μL TE溶液充分溶解，然后用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品的濃度和質(zhì)量，DNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.2ITS-PCR擴(kuò)增利用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)對(duì)香菇菌種進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為35 μL，包括：2×HiFiTaqPCRStarMix17.5 μL、引物ITS1(10 μM)和ITS4(10 μM)各0.7 μL、DNA模板1 μL，用去離子水將體積補(bǔ)至35 μL.ITS-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min，4℃保存.擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)合格的產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序.

1.3野生香菇的菌絲生長條件試驗(yàn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、硫酸鎂0.15 g、磷酸二氫鉀0.15 g、磷酸氫二鉀0.15 g、瓊脂15 g、水1 000 mL、pH自然.

1.3.1碳源試驗(yàn)供試碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉.分別以20 g的果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，配置成不同的碳源培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、倒平板，用內(nèi)徑5 mm的打孔器在活化平板培養(yǎng)基的同一半徑處打孔，接種到每一供試平板的中央，每一碳源設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)11 d，第三天開始每隔兩天利用十字交叉法測一次菌落的直徑，并且觀察菌落形態(tài)、菌絲的長勢(shì).菌絲的生長速度用(mm/d)表示.菌絲生長濃密、粗壯用“+++”表示，生長較為濃密用“++”表示，菌絲稀疏細(xì)弱用“+”表示，不生長用“-”表示.

1.3.2氮源試驗(yàn)供試氮源：硝酸銨、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、尿素.以等量的硝酸銨、硫酸銨、牛肉膏、尿素代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，配置成不同氮源的培養(yǎng)基，其余操作同1.3.1.

1.3.3無機(jī)鹽試驗(yàn)在每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入1 g氯化鈣、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵，其余操作同1.3.1.

1.3.4pH值試驗(yàn)用10%的氫氧化鈉和10%的鹽酸在滅菌前將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值調(diào)為5、6、7、8、9共5個(gè)梯度，其余操作同1.3.1.

1.3.5碳氮比試驗(yàn)以葡萄糖為碳源，以蛋白胨為氮源，以20 g葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，配制成碳氮比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1共5種配方，其余操作同1.3.1.

1.3.6菌絲生長速度的測定菌絲平均生長速度(mm/d)=所測得三個(gè)菌落半徑的平均值/生長的天數(shù).

圖2　野生香菇DNA提取結(jié)果Fig.2　Results of DNA extraction from wild Lentinula edodes注：M：λ-Hind Ⅲ diges DNA marker

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)鑒定結(jié)果

所采集的野生香菇子實(shí)體中等大，菌蓋表面平整，呈扁平或者稍扁平，周圍為淺褐色，中部為黃褐色，相比于人工栽培的菌肉肥厚香菇而言，其菌蓋較薄，表面無鱗片，邊緣不內(nèi)卷；菌柄褐色，中生，彎曲，肉質(zhì)，相比于人工栽培的香菇，其菌柄較細(xì)長；菌褶彎生不等長，白色肉質(zhì)，密集；菌肉白色厚實(shí)，具有特殊的香味，從形態(tài)上初步鑒定為野生香菇.

2.2DNA的提取

野生香菇菌株的DNA提取結(jié)果如圖2中的1、2、3.得到的野生香菇菌株DNA大小在23 130 bp附近，電泳圖中，DNA條帶清晰，DNA的濃度、純度以及產(chǎn)率都比較高，可用于PCR擴(kuò)增.

2.3野生香菇的ITS-PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果

利用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)野生香菇菌株進(jìn)行了ITS-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3.測序結(jié)果rDNA ITS區(qū)段長度為740 bp.所得序列進(jìn)行Blast搜索，Blast結(jié)果擊中(hit)均為香菇(如圖4)，序列相似性為96%，E value(期望值)為0，主要擊中香菇菌株SB104、 香菇菌株GAN046-IAMHAU、香菇菌株TMI1546、香菇菌株YUN102-IAMHAU、香菇菌株50784-ACCC、香菇菌株STCL149.Landeweert等[5]認(rèn)為ITS序列經(jīng)比對(duì)，序列相似性≥99%，屬于相同種；序列相似性大于95%，小于99%，屬于相同屬；序列相似性≤95%，屬于相同科.因此ITS分子分析結(jié)合上面形態(tài)上的鑒定，表明分離得到的野生菌株是香菇.

圖3　野生香菇rDNA ITS區(qū)段的PCR產(chǎn)物 圖4　野生香菇ITS序列BLAST結(jié)果Fig.3　PCR product of rDNA ITS of wild Lentinula edodes注：M:Direct-Load TM star marker

圖4　野生香菇ITS序列BLAST結(jié)果Fig.4　The BLAST results of rDNA ITS sequence

圖5　在不同碳源中菌絲生長曲線Fig.5　The growth curve of mycelial in different carbon source

圖6　不同氮源下菌絲的生長曲線Fig.6　The growth curve of mycelial in different nitrogen source

2.4不同的碳源對(duì)香菇菌絲生長的影響

碳源對(duì)香菇菌絲生長的影響見下表1，生長曲線見下圖5.從表1可知，供試的5種碳源均可以作為野生香菇菌絲生長的碳源，但在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲的長勢(shì)明顯低于其他幾種碳源，結(jié)合菌絲在不同碳源下的生長曲線，可以看出野生香菇在以麥芽糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長勢(shì)最好.

表1碳源對(duì)野生香菇菌絲生長的影響

Tab.1Effects of carbon sources on mycelial growth of wildLentinulaedodes

碳源平均生長速度/(mm·d-1)菌落形態(tài)菌落顏色菌絲生長勢(shì)蔗糖1.20不規(guī)則圓形灰白+葡萄糖2.73規(guī)則圓形潔白+++麥芽糖2.82規(guī)則圓形潔白+++淀粉2.48規(guī)則圓形潔白++果糖2.46規(guī)則圓形潔白+++

2.5不同氮源對(duì)香菇菌絲生長的影響

不同氮源對(duì)野生香菇菌絲生長的影響見下表2，菌絲在不同氮源下的生長曲線如圖6，從表2和圖6可以看出，香菇菌絲在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上不生長，在以硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上都能生長，總體看來菌絲在有機(jī)氮上比在無機(jī)氮上生長更好，其中在牛肉膏上生長最好，菌絲濃密、粗壯.

表2氮源對(duì)野生香菇菌絲生長的影響

Tab. 2Effects of nitrogen sources on mycelial growth of wildLentinulaedodes

氮源平均生長速度/(mm·d-1)菌絲色澤菌絲生長勢(shì)硝酸銨1.89灰白+硫酸銨2.35灰白+蛋白胨2.77潔白+++牛肉膏3.07潔白+++尿素0.00

2.6無機(jī)鹽對(duì)野生香菇菌絲生長的影響

無機(jī)鹽對(duì)野生香菇菌絲生長的影響見下表3，從表3可以看出除了硫酸亞鐵降低了菌絲的生長速度以外，其余幾種無機(jī)鹽均不同程度的促進(jìn)了菌絲的生長，其中硫酸鎂效果最明顯.

2.7不同pH值對(duì)香菇菌絲生長的影響

野生香菇菌絲在不同pH值下的平均生長速度見下圖7，野生香菇菌絲在pH值為5～9中均能生長，在pH值為6時(shí)生長最好，菌絲濃密，但是菌落不規(guī)則，pH為7～9時(shí)菌絲生長速度逐漸下降，總體來說在偏酸性環(huán)境中生長的更好.

表3無機(jī)鹽對(duì)野生香菇菌絲生長的影響

Tab.3Effects of mineral salt on mycelial growth of wildLentinulaedodes

無機(jī)鹽平均生長速度/(mm·d-1)菌落形態(tài)菌絲色澤菌絲生長勢(shì)氯化鈣2.82不規(guī)則圓形潔白+氯化鈉2.75不規(guī)則圓形灰白++硫酸亞鐵0.98不規(guī)則圓形灰白+磷酸二氫鉀2.38規(guī)則圓形潔白+++硫酸鎂2.94規(guī)則圓形潔白+++

圖7　pH值對(duì)野生香菇菌絲生長速度的影響Effects of pH value on mycelial growth of wild Lentinula edodes

圖8　在不同碳氮比下菌絲生長曲線Fig.8　The growth curve of mycelial indifferent C/N ratio

2.8碳氮比的影響

碳氮比對(duì)香菇菌絲生長的影響見下表4，不同碳氮比下的生長曲線見下圖8，從表4和圖8可以看出在供試的五種碳氮比中，菌絲都能夠生長.所有菌落均表現(xiàn)出規(guī)則圓形，生長速度最快的是30∶1，從30∶1到50∶1隨著碳氮比的增加，菌絲生長速度逐漸減慢，說明氮源過低不利于菌絲的生長.

表4不同碳氮比對(duì)野生香菇菌絲生長的影響

Tab. 4Effects of carbon-nitrogen ratio on mycelial growth of wildLentinulaedodes

碳氮比菌絲平均生長速度/(mm·d-1)菌絲色澤菌絲生長勢(shì)10∶11.91潔白++20∶11.93潔白++30∶12.39潔白+++40∶11.80灰白+50∶11.48灰白+

3結(jié)論與討論

在云南省云縣采集的一株野生菌株通過形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)技術(shù)可以確定該菌株就是香菇.對(duì)該野生香菇進(jìn)行了菌絲生長條件的研究，該實(shí)驗(yàn)表明，該野生香菇菌絲生長的最適碳氮源分別為麥芽糖和牛肉膏，菌絲不但生長快，而且色澤潔白菌絲濃密，長勢(shì)旺盛.菌絲在pH值為5～9中均能生長，在pH為6時(shí)菌絲生長最快，菌絲生長濃密.無機(jī)鹽對(duì)香菇菌絲的生長有一定的促進(jìn)作用，特別是硫酸鎂和氯化鈉.菌絲在C/N為10∶1～50∶1的范圍內(nèi)均可以生長，但以C/N為30∶1時(shí)菌絲生長最快，菌絲濃密粗壯、長勢(shì)旺盛.我國地域廣闊，生態(tài)環(huán)境多樣，香菇種質(zhì)資源十分豐富，在香菇育種中應(yīng)更多地引進(jìn)我國豐富的野生香菇種質(zhì)資源[10].在香菇生產(chǎn)的三大要素(菌種、培養(yǎng)料、栽培管理)中，菌種是最重要的基礎(chǔ)生產(chǎn)資料，是影響香菇產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵要素[11]，了解野生香菇的生物學(xué)特性將為香菇的生產(chǎn)栽培提供依據(jù).

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責(zé)任編輯：高山

Identification of a Strain of WildLentinulaedodesand Study on the Optimum Growth Conditions of its Mycelium

YUAN Siming,FANG Lili，HE De*,LI Cuixin*

(College of Life Science,South West Forestry University,Kunming 650224,China)

Abstract：n order to identify a strain of wild Lentinula edodes exactly,we conducted some experiments using its rDNA ITS sequences analysis and morphological identification.The results indicated that this wild strain is Lentinula edodes.Some studies on the optimum growth rate of its mycelium in this paper showed that the best carbon source was maltose,the optimum nitrogen source was beef extract,the optimum C/N was 30∶1,the optimum pH value range was 5 to 6,and magnesium sulfate could promote the growth of its mycelium.

Key words：Lentinula edodes;identification;carbon source;nitrogen source

收稿日期：2016-01-18.

基金項(xiàng)目：云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(50097505)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目基金(2011FZ141)；云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(51400605)；西南林業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金(111046).

作者簡介：袁思明(1989- )，女，碩士生，主要從事微生物學(xué)的研究;*通信作者：李翠新(1972- )，女，博士，副教授，主要從事食用菌栽培與利用的研究；何德(1970- )，男，博士，副教授，主要從事分子細(xì)胞生物學(xué)的研究.

文章編號(hào)：1008-8423(2016)01-0077-04

DOI:10.13501/j.cnki.42-1569/n.2016.03.020

中圖分類號(hào)：S646

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A