翟 煜，霍小林，王永利

(1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，天津 300070 2.中國科學(xué)院電工研究所，北京 100000 3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，天津 300070)

左旋組氨酸對(duì)匹羅卡品致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)肽Y表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究*

翟 煜1，霍小林2，王永利3**

(1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，天津 300070 2.中國科學(xué)院電工研究所，北京 100000 3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，天津 300070)

摘 要:目的:實(shí)驗(yàn)研究左旋組氨酸對(duì)匹羅卡品致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)肽Y表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響。方法:統(tǒng)計(jì)分析60只Ⅱ級(jí)健康純系雄性SD大鼠的相關(guān)資料。結(jié)果:研究組和對(duì)照組大鼠建模成功率78.3%(18/ 23)、77.3%(17/ 22)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；研究組大鼠的潛伏期顯著長于對(duì)照組(P＜0.05)，癇波頻率低于對(duì)照組(P＜0.05)，大發(fā)作次數(shù)少于對(duì)照組(P＜0.05)，成功建模動(dòng)物模型后1d、2d、3dCA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回神經(jīng)肽Y陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于對(duì)照組(P＜0.05)，凋亡染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論:左旋組氨酸能夠有效降低匹羅卡品致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)肽Y表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)值，具有抗癇作用。

關(guān)鍵詞:左旋組氨酸； 匹羅卡品致癇大鼠； 海馬區(qū)神經(jīng)肽Y表達(dá)； 神經(jīng)細(xì)胞凋亡

**通訊作者

為臨床有效治療癲癇提供科學(xué)依據(jù)，本研究對(duì)60只Ⅱ級(jí)健康純系雄性SD大鼠的相關(guān)資料進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)研究了左旋組氨酸對(duì)匹羅卡品致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)肽Y表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:購買北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的60只Ⅱ級(jí)健康純系雄性SD大鼠，體重240～260g，平均體重為(250±10)g。所有大鼠均接受常規(guī)飼養(yǎng)、自由進(jìn)食等。隨機(jī)將這些大鼠分為研究組(n=30)和對(duì)照組(n = 30)兩組。給予研究組匹羅卡品聯(lián)合左旋組氨酸治療，給予對(duì)照組單純匹羅卡品治療。給予兩組腹腔注射350mg/ kg體重劑量匹羅卡品，以對(duì)顳葉癲癇模型進(jìn)行誘導(dǎo)，依據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)中動(dòng)物行為特征分癲癇為5個(gè)級(jí)別，如果大鼠嘴部和面部運(yùn)動(dòng)具有節(jié)律性，代表為咀嚼、頭部陣攣，則評(píng)定為Ⅰ級(jí)；如果大鼠點(diǎn)頭，則評(píng)定為Ⅱ級(jí)；如果大鼠前肢出現(xiàn)陣攣現(xiàn)象，則評(píng)定為Ⅲ級(jí)；如果大鼠身體出現(xiàn)上舉現(xiàn)象，則評(píng)定為Ⅳ級(jí)；如果大鼠身體出現(xiàn)上舉伴跌倒現(xiàn)象，則評(píng)定為Ⅴ級(jí)。癲癇模型成功誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)為Ⅲ級(jí)以上，將沒有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的大鼠剔除，另行補(bǔ)充。

1.2方 法

1.2.1藥品和試劑:購買Sigma公司生產(chǎn)的左旋組氨酸(L-His)、匹羅卡品(PLO)等，購買廣州市鴻洲實(shí)驗(yàn)器材有限公司生產(chǎn)的磷酸鹽緩沖液，購買德國寶靈曼公司生產(chǎn)的原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購買天津市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的水合氯醛(AGAC)及分析純。

1.2.2皮質(zhì)腦電圖檢測(cè):給予大鼠模型腹腔注射300mg/ kg水合氯醛進(jìn)行麻醉，將腦電記錄電極安置其中。固定后將骨孔從大鼠顱骨雙側(cè)額葉皮質(zhì)、頂葉皮質(zhì)相應(yīng)部位打開，骨孔直徑為1mm，將銀、氯化銀球形記錄電極分別插入。在大鼠前鹵后2mm安置參考電極。術(shù)后進(jìn)行5d的休養(yǎng)，然后開始皮質(zhì)腦電圖檢測(cè)。將記錄裝置連接起來，對(duì)腦電路記錄的正確可靠情況進(jìn)行認(rèn)真檢查。給予對(duì)照組大鼠腹腔注射350mg/ kg匹羅卡品建模，然后對(duì)其2h皮質(zhì)腦電圖進(jìn)行連續(xù)記錄；給予干預(yù)組大鼠腹腔注射300mg/ kg左旋組氨酸，1h后給予其腹腔注射250mg/ kg匹羅卡品建模。將2h內(nèi)皮質(zhì)腦電圖變化數(shù)據(jù)連續(xù)記錄[1]。

1.2.3皮質(zhì)腦電圖分析指標(biāo):腹腔注射匹羅卡品到癇波首次出現(xiàn)的時(shí)間段為潛伏期。為時(shí)程為1min的腦電圖中尖波/棘波數(shù)值計(jì)數(shù)，每隔12min 1次，2h共將采集10個(gè)數(shù)值，每分鐘癇波頻率即為該組數(shù)據(jù)平均數(shù)。大發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)癇波時(shí)間在10s以上，將數(shù)據(jù)詳細(xì)記錄，將每組數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算出來[2]。

1.2.4神經(jīng)肽Y檢測(cè):應(yīng)用鏈霉卵白素-過氧化物酶(Histontain-SP)試劑盒，運(yùn)用第二代LAB-SA技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)肽Y。運(yùn)用親和純化的二抗和Histontain-SP軛合物對(duì)已經(jīng)在組織細(xì)胞抗原上結(jié)合的一抗進(jìn)行檢測(cè)，通過酶催化底物對(duì)所形成的抗原/抗體/酶復(fù)合物進(jìn)行反映，從而將抗原的位置及分布確定下來[3～5]。

1.2.5病理組織取材方法:成功建模動(dòng)物模型后1d、2d、3d將每組10只建模大鼠分別抽取出來，給予其腹腔注射350mg/ kg水合氯醛試液進(jìn)行麻醉，開胸在4℃的環(huán)境下行升主動(dòng)脈灌流250mL 4%多聚甲醛+250mL生理鹽水。取出腦，將其固定在4%多聚甲醛溶液中。將海馬取出來，將最大剖面冠狀切開，將厚度為6μm的石蠟切片制備出來，進(jìn)行細(xì)胞凋亡染色，染色過程中嚴(yán)格依據(jù)凋亡檢測(cè)試劑盒設(shè)計(jì)程序進(jìn)行[6]。

1.2.6凋亡染色分析:凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核在凋亡染色后的顏色為棕色或棕褐色，光學(xué)顯微鏡下對(duì)CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回進(jìn)行觀察，高倍視野(10×20)下將6個(gè)區(qū)域從130μm×130μm網(wǎng)格中隨機(jī)選取出來，區(qū)域面積為0.0169m2，計(jì)數(shù)神經(jīng)肽Y陽性細(xì)胞數(shù)及染色凋亡的陽性細(xì)胞，對(duì)顆粒細(xì)胞層NPY陽性反應(yīng)密度比值進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程中用圖像分析系統(tǒng)，將每組數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差值計(jì)算出來。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用軟件SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用(±s)表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，單因素用方差分析(One -Way ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠建模成功情況比較:研究組和對(duì)照組大鼠建模成功率78.3%(18/23)、77.3%(17/22)之間的差異不顯著(P＞0.05)，具體見表1。

2.2兩組潛伏期、癇波頻率及大發(fā)作次數(shù)比較:研究組大鼠的潛伏期顯著長于對(duì)照組(P＜0.05)，癇波頻率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，大發(fā)作次數(shù)顯著少于對(duì)照組(P＜0.05)，具體見表2。

表1　兩組大鼠建模成功情況比較n(%)

2.3兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬各區(qū)神經(jīng)肽Y陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況比較:研究組大鼠成功建模動(dòng)物模型后1d、2d、3d CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回神經(jīng)肽Y陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，具體見表3。

表2　兩組潛伏期、癇波頻率及大發(fā)作次數(shù)比較(±s)

表2　兩組潛伏期、癇波頻率及大發(fā)作次數(shù)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別　只數(shù)　潛伏期(s)癇波頻率( / min)大發(fā)作次數(shù)(次)研究組　30　475±112.5* 136.7±24.6* 21.8±3.56*對(duì)照組　30　117.6±37.13 386.68±60.38 94.2±23.2

表3　兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬各區(qū)神經(jīng)肽Y陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況比較(個(gè)，±s)

表3　兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬各區(qū)神經(jīng)肽Y陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況比較(個(gè)，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別　只數(shù)　時(shí)間　只數(shù)　CA1區(qū)　CA3區(qū)　齒狀回研究組　30　1d　10　24.30±3.35*　31.40±2.13*　19.10±1.79* 2d　10　25.20±1.14*　34.50±5.52*　20.40±0.84* 3d　10　25.60±3.05*　32.60±1.95*　19.80±2.17*對(duì)照組　30　1d　10　37.60±4.98　49.20±10.38　31.20±3.83 2d　10　55.20±4.09　64.60±11.10　31.60±1.14 3d　10　60.00±1.00　80.67±8.39　29.33±1.53

2.4兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬各區(qū)凋亡染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況比較:研究組大鼠成功建模動(dòng)物模型后1d、2d、3dCA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回凋亡染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，見表4。

表4　兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬各區(qū)凋亡染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況比較(個(gè)，±s)

表4　兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬各區(qū)凋亡染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況比較(個(gè)，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別　只數(shù)　時(shí)間　只數(shù)　CA1區(qū)　CA3區(qū)　齒狀回研究組　30　1d　10　23.30±6.83*　24.56±5.41*　21.83±4.05* 2d　10　19.46±4.93*　21.66±7.43*　17.37±4.95* 3d　10　15.74±6.92*　20.13±5.20*　16.47±5.57*對(duì)照組　30　1d　10　44.2±1.30　47.4±2.30　33.4±2.07 2d　10　36.8±0.84　28.2±3.42　29.6±1.14 3d　10　40.5±2.12　37±7.07　32±1.41

3 討 論

本研究結(jié)果表明，研究組和對(duì)照組大鼠建模成功率78.3%(18/23)、77.3%(17/22)之間的差異不顯著(P＞0.05)；研究組大鼠的潛伏期顯著長于對(duì)照組(P＜0.05)，癇波頻率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，大發(fā)作次數(shù)顯著少于對(duì)照組(P＜0.05)，成功建模動(dòng)物模型后1d、2d、3d CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回神經(jīng)肽Y陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，凋亡染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，充分說明了左旋組氨酸能夠有效降低匹羅卡品致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)肽Y表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)值，同時(shí)顯著延長大鼠的潛伏期，降低大鼠的癇波頻率，減少大鼠的大發(fā)作次數(shù)，具有抗癇作用，值得臨床推廣。

參考文獻(xiàn):

[1] 葛宇星.ClC-2對(duì)慢性顳葉癲癇大鼠海馬CA1區(qū)α5亞基-GABA_AR介導(dǎo)緊張性抑制的影響[D].復(fù)旦大學(xué)，2012.

[2] 程蕊.NAP對(duì)匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用[D].山東大學(xué)，2012.

[3] 張帆.重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)肽Y基因轉(zhuǎn)染對(duì)海人酸致癇大鼠海馬突觸重建的影響及其機(jī)制研究[D].河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

[4] 董長征.重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)肽Y基因轉(zhuǎn)染對(duì)紅藻氨酸致癇大鼠癲癇發(fā)作的影響及其機(jī)制探討[D].河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

[5] 孟春想.柴胡皂苷a對(duì)難治性癲癇大鼠癇性發(fā)作及P-GP表達(dá)的影響[D].南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

[6] 黃彥思，林云賓，馮婉萍，等.癲癇兒童智能和適應(yīng)能力分析及抗癲癇藥物治療的影響[J].河北醫(yī)學(xué)，2015，20(8): 1390～1394.

Experimental Study of Influences of L-histidine in Y Neuropeptide Expression on the Hippocampus and Neuronal Apoptosis of Pilocarpine-induced Seizures Rats

ZHAI Yu，HUO Xiaolin，WANG Yongli
(Physiology and Pathophysiology Department of Basic Medical Faculty，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)

Abstract:Objective: To experimentally study the influences of L-histidine on Y neuropeptide expression in the hippocampus and neuronal apoptosis of pilocarpine-induced seizures rats. Method: The relevant information of 60 cases of Class II healthy pure male SD rats were statistically analyzed. Result: The difference of modeling success rate between the study group and the control group was not significant (P＞0.05)；The latency of the study group was significantly longer than that of the control group ( P＜0.05)，epilepsy wave frequency was significantly lower (P＜0.05)，the large number of attacks was significantly lower (P＜0.05)，the modeled after successful animal model of 1d，2d，3d CA1 area，CA3 region，tooth Neuropeptide Y-shaped back positive cell counts were significantly lower (P＜0.05)，the apoptosis staining positive cell counts were significantly lower than those of the control group (P＜0.05). Conclusion: L-histidine can ef-book=2,ebook=6fectively reduce the L-histidine in Y neuropeptide expression in the hippocampus and neuronal apoptosis value of pilocarpine-induced seizures rats，it has anti-epileptic effect.

Key words:L-histidine； Pilocarpine-induced seizures rats； Y neuropeptide expression in the hippocampus； Neuronal apoptosis

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.01.001

文章編號(hào):1006-6233(2016)01-0001-04

*基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金，(編號(hào):50307013)