張騰龍，薄樂(lè)，英那，郝文麗，武智勇，王雄，孟軻音，萬(wàn)家余，陳志寶（.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶6339；.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所）

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朊病毒病生物標(biāo)記microRNA-142-3p可視化快速檢測(cè)

張騰龍1，2，薄樂(lè)1，2，英那2，郝文麗1，武智勇1，王雄1，孟軻音2，萬(wàn)家余2，陳志寶1
（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319；2.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所）

摘要：為了更快捷、方便的檢測(cè)朊病毒病，根據(jù)已有報(bào)道確定microRNA-144-3p作為朊病毒病的生物標(biāo)記，通過(guò)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)公布的microRNA-142-3p的核酸序列，設(shè)計(jì)特異性標(biāo)記有生物素的俘獲探針和標(biāo)記有FAM的檢測(cè)探針，從而建立了納米金偶聯(lián)核酸試紙條的高效，快捷，可視化檢測(cè)方法。結(jié)果表明：該檢測(cè)方法具有良好的特異性和較高的靈敏度（0.005 nmol·L-1）。該檢測(cè)試紙條的建立在朊病毒病預(yù)防，控制，診斷過(guò)程中具有一定實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞：朊病毒；microRNA-142-3p；生物標(biāo)記；可視化；檢測(cè)

朊病毒?。╬rion disease）是一種致死性，傳染性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該疾病變種較多，其中瘋牛病已經(jīng)打破中間屏障成為嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康人畜共患病之一[1]。目前普遍認(rèn)為這類疾病的致病因子就是本體細(xì)胞中正常的朊蛋白（PrPC）發(fā)生結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤折疊形成致病型蛋白（PrPSc），這種蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)的抗逆性，對(duì)較高的溫度、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、抗生素和干擾素、酶的耐受性很強(qiáng)。因此，它能在神經(jīng)細(xì)胞中大量聚集沉淀、引起神經(jīng)細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)紊亂、神經(jīng)元空泡化大量死亡[2]。正是由于它抗逆性極強(qiáng)，同時(shí)也因?yàn)殡貌《静“l(fā)病機(jī)理至今仍不清楚，朊病毒病尚未有效的預(yù)防和治療措施[3]。人們普遍認(rèn)為，人和動(dòng)物體內(nèi)存在某種因子對(duì)朊病毒感染、致病起著重要的調(diào)控作用，這種未知因子影響人們對(duì)朊病毒病發(fā)病機(jī)理的理解，朱淼等人利用模式動(dòng)物-新秀麗線蟲驗(yàn)證了銅離子對(duì)朊病毒病有一定的抑制作用[4]，當(dāng)然科學(xué)家們也從來(lái)未停止對(duì)這種未知因子的探索。

由于這種疾病的高致病性、高致死率，對(duì)其的預(yù)防與檢測(cè)也從來(lái)沒(méi)有間斷過(guò)。病理組織切片、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)、Western Blotting和熒光定量PCR等技術(shù)提供了高親和性、高靈敏性、高特異性的檢測(cè)方法，但是這些檢測(cè)方法需要很長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，專門的檢測(cè)儀器、煩瑣、復(fù)雜的檢測(cè)程序并且要求要具有一定專業(yè)技能的人員操作，檢測(cè)使用的材料價(jià)格昂貴，具有很強(qiáng)的局限性。因此，需要一種更簡(jiǎn)單、快速、可視化、成本低廉的檢測(cè)方法。

隨著科學(xué)工作者對(duì)這類疾病更深入的研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子RNA表達(dá)情況與很多疾病相關(guān)，例如一些肝病、腎病、神經(jīng)性疾病甚至癌癥[5]，因此這類小分子RNA可以作為疾病診斷的生物標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)構(gòu)建感染羊瘙癢因子22L毒株的小鼠鼠腦microRNA芯片，結(jié)合熒光定量PCR對(duì)microRNA表達(dá)情況的分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-142-3p表達(dá)量明顯高于正常小鼠。因此，我們micoRNA-142-3p確定為朊病毒病發(fā)病的重要生物學(xué)標(biāo)記（Biomarker）。通過(guò)制備特異性核酸試紙條檢測(cè)朊病毒病相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記，從而間接檢測(cè)朊病毒病。

1　材料與方法

1.1材料

顆粒直接為13 nm的納米金溶液有中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所惠贈(zèng)。感染羊瘙癢因子22L毒株的小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞（ScN2a）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院十一所空氣生物學(xué)與呼吸道病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。microRNA-144-3p，俘獲探針，檢測(cè)探針（見表1）均委托上海生工生物公司合成，其中俘獲探針使用生物素修飾，檢測(cè)探針使用FAM修飾，PVDF膜。

1.2主要試劑與儀器

主要試劑：50 mM Na2HPO4┌0.5 M NaCl，pH 6.8；滅菌后，4℃保存。小牛血清和PVDF膜購(gòu)自大連寶生公司（Takara），DEPC水，Trizol@Reagent。氯仿，異丙醇，無(wú)水乙醇，戊二醛購(gòu)自與北京化工廠，生物素抗體和FAM抗體。

主要儀器：UMAX Powerlook掃描儀掃描。

表1　試驗(yàn)中所用microRNA以及探針序列Table 1microRNA and probe sequence in the test

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1可視化核酸檢測(cè)試紙條的制備

試紙條的制備參照杭州優(yōu)思達(dá)公司徐高聯(lián)等[6]的方法制備。吸取新制備的紅色納米金溶液2 mL于潔凈的離心管中，1 000 rpm離心5分鐘，棄去上層清液，加入1.5 mL去離子水將納米金顆粒重懸，1 000 rpm離心1 min，該步驟重復(fù)一次。將收集的紅色納米金顆粒轉(zhuǎn)移至新的潔凈的離心管中，加入FAM抗體（10 mg·mL-1）的戊二醛緩沖溶液，20℃孵育3小時(shí)。然后8 000 rpm離心10 min，收集已經(jīng)包被有抗生蛋白鏈菌素的納米金顆粒并向其中加入羥胺，20℃孵育30 min后，將其錨定在結(jié)合板上。生物素抗體使用1×PBS緩沖溶液稀釋，充分混勻后，均勻涂布一條線作為試紙條的檢測(cè)線，將FAM溶解于1× PBS緩沖溶液中充分混勻后，涂布一條線作為試紙條的質(zhì)控線。將試紙條放置在37℃烘箱內(nèi)干燥2小時(shí)，然后按照5 mm×5 cm的規(guī)格剪成條狀，并在試紙條靠近結(jié)合板一端貼點(diǎn)樣板，內(nèi)一端則粘貼吸水板。這樣有利于反應(yīng)產(chǎn)物快速流經(jīng)PVDF膜，便于可視化檢測(cè)。

1.3.2核酸雜交反應(yīng)

將合成的檢測(cè)探針和俘獲探針經(jīng)過(guò)短暫離心后，用已配置好的SPSC緩沖溶液稀釋為成相應(yīng)濃度，在此過(guò)程中應(yīng)避光操作。將合成的microRNA-142-3p用SPSC緩沖溶液稀釋備用。吸取10 μL俘獲探針于潔凈的200 μL離心管中，等體積加入不同濃度的microRNA-142-3p和檢測(cè)探針，充分混勻后，95℃加熱5分鐘25℃孵育10分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物用于核算試紙條檢測(cè)。

1.3.3ScN2a細(xì)胞總RNA的提取

（1）取鑒定完畢且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N2a細(xì)胞和ScN2a細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105cell·mL-1，分別接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，用于提取細(xì)胞總RNA。

（2）每孔中加入1 mL Trizol試劑將對(duì)照組（N2a）和實(shí)驗(yàn)組（ScN2a）消化并轉(zhuǎn)移到RNase-free的離心管中，激烈震蕩15秒后，冰浴靜置10 min。

（3）向離心管中加入200微升氯仿，反復(fù)顛倒混勻后，劇烈震蕩20秒，冰浴靜置10分鐘，待混合液分層后，4℃，14 000 rpm離心15 min。

（4）離心后溶液分三層，小心吸取400 μL上層清液于新1.5 mL RNase-free的離心管中，向每管中加入500 μL異丙醇，劇烈震蕩混合均勻，冰浴靜置10 min后，4℃，14 000 rpm離心10 min。

（5）棄上層清液，使用潔凈的濾紙吸去殘余液體后，向每管中加入75%乙醇，反復(fù)顛倒漂洗，4℃，8 000 rpm離心15 min。重復(fù)此步驟兩次。

（6）棄掉上清液，自然風(fēng)干管內(nèi)殘余液體后，加入20～50 μL RNase-free water重新溶解，溶液即為細(xì)胞總RNA。

（7）對(duì)所提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.3.4利用核酸試紙條進(jìn)行可視化檢測(cè)

吸取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物滴加在試紙條的點(diǎn)樣板上，隨后向點(diǎn)樣板滴加100 μL的runnin buffer，室溫水平放置30 min內(nèi)觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.3.5靈敏度檢測(cè)和特異性檢測(cè)

特異性檢測(cè)：我們選取了四種其他microRNA作為對(duì)照，通過(guò)上述方法，對(duì)其進(jìn)行特異性評(píng)估。

靈敏性檢測(cè)：將microRNA-142-3p稀釋成不同的濃度，然后按照上述檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的靈敏性，無(wú)限降低靶標(biāo)的濃度，確定該法的檢測(cè)極限。

1.3.6對(duì)模擬樣品的檢測(cè)

使用Trizol試劑將貼壁的感染羊瘙癢因子22L毒株的小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞（ScN2a）和正常小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞（N2a）消化，沉淀，洗滌，溶解提取細(xì)胞總RNA，按照1.1.2和1.1.4中操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7所有檢測(cè)試紙條結(jié)果均通過(guò)UMAX Powerlook掃描儀掃描

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1特異性檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)選取五種不同的microRNA：microRNA-215，microRNA-122，microRNA-21，microRNA-448 和microRNA-142-3p按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，只有microRNA-144-3p和五種microRNA的混合溶液的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其他四種microRNA的檢測(cè)結(jié)果呈陰性（見圖1），從而證明這種可視化檢測(cè)方法具有較好的特異性。

圖1　microRNA-3p-144特異性檢測(cè)Fig.1Specific detection of target microRNA-142-3p

2.2靈敏性檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)將microRNA-142-3p稀釋成為十一個(gè)濃度梯度，隨著靶標(biāo)濃度的降低，檢測(cè)線的顏色也隨之變淺。通過(guò)梯度降低靶標(biāo)濃度，確定了該方法的檢測(cè)極限為0.005 nM（見圖2）

圖2　目標(biāo)microRNA-144-2p靈敏度檢測(cè)Fig.2Sensitivity of detecting target microRNA-142-3p

2.3感染羊瘙癢因子22L毒株的ScN2a細(xì)胞檢驗(yàn)

我們將提取ScN2a細(xì)胞總RNA稀釋三個(gè)濃度梯度，作為模板，使用同樣的復(fù)活探針和檢測(cè)探針，按照1.3.1和1.3.3所示的核酸雜交與檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞中microRNA-144-3p進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：三個(gè)濃度梯度的總RNA檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性（見圖3），其中原液檢測(cè)線清晰，顏色較對(duì)照組明顯加深。

圖3　目標(biāo)microRNA-144-3p的細(xì)胞模擬樣本檢驗(yàn)Fig.3 Mimetic cell samples test of target microRNA-144-3p

3　討論

自從首例瘋牛病于1986年在英國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已經(jīng)多次引起了全球性威脅，對(duì)人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了巨大損失并引發(fā)了許許多多的社會(huì)問(wèn)題。有研究證明，瘋牛病已經(jīng)打破種間屏障，是一種高致病性，高致死率的人畜共患病，它的傳播途徑多樣化，主要以食用感染瘋牛病的肉制品在動(dòng)物與人類之間傳播，嚴(yán)重威脅食品衛(wèi)生安全與人類健康。

microRNAs是內(nèi)源性非編碼約23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈RNA分子[7-8]。miRNA在不同病理和生物過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化，心血管疾病，神經(jīng)障礙性疾病以及癌癥中發(fā)揮著重要的作用[9-10]。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因芯片和熒光定量PCR的方法檢測(cè)到microRNA-144p的表達(dá)量在正常小鼠和感染羊瘙癢病22L毒株的小鼠腦部表達(dá)具有非常顯著的差異。因此，microRNA-142-3p可以作為檢測(cè)朊病毒病的生物標(biāo)記，所選取對(duì)照組均是與癌癥或者神經(jīng)退行性疾病相關(guān)并且非常常見的幾種分子，它們的核酸序列較短，同目標(biāo)microRNA分子序列相似，可以用于特異性檢測(cè)的對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立快速，高效，低成本的可視化段片段核酸檢測(cè)方法，針對(duì)microRNA-142-3p進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)感染22L毒株的神經(jīng)瘤細(xì)胞中該分子的含量明顯高于未感染的細(xì)胞，結(jié)果與廖翔宇[9]和劉志培[10]的基因芯片和熒光定量PCR趨勢(shì)相符合。實(shí)驗(yàn)采用納米金偶聯(lián)核酸試紙條的方法，方便攜帶，更加快捷，而且所用材料本身對(duì)人體危害較小，具有安全實(shí)用的特點(diǎn)。由于細(xì)胞總RNA中包含RNA種類偏多，可能稍微會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果的精確度，如何在實(shí)際肉質(zhì)食品安全監(jiān)測(cè)中得到較為單一的檢測(cè)靶標(biāo)仍然值得我們探索，其次就是單一寡居核酸檢測(cè)確具有較高的靈敏度，為了達(dá)到為靈敏度和檢測(cè)范圍的更高要求，應(yīng)該考慮到檢測(cè)信號(hào)的擴(kuò)大化以及針對(duì)多條變化趨勢(shì)相同的核酸，這也作為實(shí)驗(yàn)室著力研究的重點(diǎn)。

4　結(jié)論

針對(duì)目標(biāo)microRNA-142p設(shè)計(jì)相對(duì)特異性的俘獲探針和檢測(cè)探針，結(jié)合納米金材料達(dá)到了可視化檢測(cè)的目的，建立了比較靈敏，快捷，簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法。為預(yù)防，控制，診斷朊病毒病提供了有利參考。

參考文獻(xiàn)：

［1］Wan J，Bai X，Liu W，et al.Polymorphism of prion protein gene in Arctic fox（Vulpes lagopus）［J］.Molecular Biology Reports，2009，36（6）：1299-1303.

［2］Prusiner S B.Prion［J］.PNAS，1998，95：13363-13383.

［3］Soto C.Prion hypothesis：the end of the controversy［J］. Trends Biochem Sci，2011，36（3）：151-158.

［4］朱淼，高躍，李忠義，等.銅離子對(duì)PrP轉(zhuǎn)基因線蟲的影響［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，25（6）：43-47.

［5］Jin G，Sun J，Isaacs SD，et al.Human polymorphisms at long noncoding RNAs（lncRNAs）and association with prostate cancer risk［J］.Carcinogenesis，2011（32）：1655-1659.

［6］Gao l X，Qi M Y，Sam P，et al.Application of PCRLDR-Nucleic Acid Detecion Strip in Detecion of YMDD Mutation in Hepatitis B Patients Treated With Lamivudine ［J］.Journal of Medical Virology，2010（82）：1143-1149.

［7］Lee Y，Ahn C，Han J，et al.The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing［J］.Nature，2003 （425）：415-419.

［8］Wittmann J，Jack H M.Serum microRNAs as powerful cancer biomarkers［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1806：200-207.

［9］Liao X Y，Wan J Y，Liu W S，et al.Using Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry to analyze differentially expressed brain polypeptides in scrapie strain 22L-infected BALB/c mice［J］.Neural Regen Res，2011（23）：1801-1805.

［10］劉志培，孟軻音，鞠傳靜，等.朊病毒病相關(guān)miRNA在不同發(fā)病臟器和細(xì)胞中表達(dá)的變化［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013，26（10）：1434-1444.

Visualized Detection of Prion Disease of Biomarker MicroRNA-14-3p

Zhang Tenglong1，2，Bo Le1，Ying Na2，Hao Wenli1，Wu Zhiyong1，Wang Xiong1，Meng Keyin2，Wan Jiayu2，Chen Zhibao1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Institute of Military Veterinary，Academy of Military Medical Sciences）

Abstract:For the purpose of detecting prion disease more rapidly and conveniently，microRNA-144-3p has been considered as a biomarker for prion disease according to the pre-report.Based on miRBse sequence，the specific capture probe with marked biotin and detecting probe with marked FAM were designed in order to establish the high efficiency，rapid and visualized detection method，which coupled with nano-gold and nucleic indicator paper.Therefore，this method made a good foundation to prevent，control，diagnose prion diseases.

Key words：prion；microRNA-144-3p；biomarker；visualization；detection

中圖分類號(hào)：S865.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2090（2016）01-0064-04

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.014

收稿日期：2015-03-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（3120197）；國(guó)家自然科學(xué)基金（3120114）。

作者簡(jiǎn)介：張騰龍（1988-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

通訊作者：陳志寶，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenzhibao 2000@sina.com。