劉 通，李澤青，閆 峻，李 寧，穆淑琴，李 馳，馬 墉，王文杰

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所；4.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心

構(gòu)建Diquat誘導(dǎo)斷奶仔豬氧化應(yīng)激模型的研究

劉 通1，李澤青2，閆 峻3,4,*，李 寧1，穆淑琴3,4，李 馳1，馬 墉3,4，王文杰3,4

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所；4.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心

試驗(yàn)通過觀察斷奶仔豬一次性腹腔注射Diquat后生長性能、血液生化及抗氧化指標(biāo)的變化，驗(yàn)證氧化應(yīng)激模型是否構(gòu)建成功，并進(jìn)一步探明用來評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的敏感指標(biāo)。選用DLY斷奶仔豬10頭，體重10.64±1.08 kg，隨機(jī)分配到2個(gè)組中，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。處理組按體重一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液，對(duì)照組腹腔注射相同劑量的滅菌生理鹽水。試驗(yàn)期21 d，在試驗(yàn)第3、10、21天空腹前腔靜脈采血，檢測(cè)血清生化及抗氧化指標(biāo)。結(jié)果表明，Diquat顯著降低仔豬ADG和ADFI(\%P\%<0.01)，顯著提高血液中ALT、AST活性和COR含量(\%P\%<0.05)，顯著降低血液中GSH-Px活力(\%P\%<0.05)。試驗(yàn)表明，一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可以誘導(dǎo)斷奶仔豬氧化應(yīng)激，應(yīng)激效應(yīng)可持續(xù)21 d以上，血液中ALT、AST、GSH-PX活力以及COR含量可作為評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的指標(biāo)。

Diquat；斷奶仔豬；氧化應(yīng)激；模型

The Construction Method of Diquat Induced Oxidative Stress Model of Weaned Pigs

氧化應(yīng)激是指當(dāng)動(dòng)物受到各種有害刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)高活性分子物質(zhì)如活性氧自由基和活性氮自由基過量產(chǎn)生，氧化程度超出氧化物的清除，機(jī)體處于過氧化損傷的一種狀態(tài)。出生、斷奶、環(huán)境等多種因素均可誘導(dǎo)畜禽體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。生產(chǎn)過程中，氧化應(yīng)激極大降低了畜禽的生產(chǎn)性能和免疫力，進(jìn)而引發(fā)疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。為深入研究氧化應(yīng)激的機(jī)制及抗應(yīng)激措施，建立穩(wěn)定的氧化應(yīng)激模型非常重要。Diquat 是二吡啶基除草劑，有研究表明，Diquat能利用分子氧產(chǎn)生O2-和H2O2，其誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激程度取決于劑量和次數(shù)，易于操作和控制，可作為構(gòu)建氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)物。本試驗(yàn)通過給斷奶仔豬一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液，考察氧化應(yīng)激的持續(xù)時(shí)間和血液敏感指標(biāo)變化，構(gòu)建穩(wěn)定的仔豬氧化應(yīng)激模型。

1 材料與方法

1.1 材料

Diquat(水劑，有效成分20%)購于河北榮威生物藥業(yè)有限公司 。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

選取健康、體重相近(10.60±1.10 kg)杜×長×大三元雜交斷奶仔豬30頭(公母各半)，隨機(jī)分為2個(gè)處理組，每個(gè)處理3重復(fù)，每重復(fù)5頭豬。對(duì)照組每頭豬腹腔注射2 mL滅菌生理鹽水，處理組每頭豬一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液2 mL。

1.3 試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)日糧參考NRC (2012)10～20 kg仔豬營養(yǎng)需要配制，組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

組成(%)營養(yǎng)水平玉米豆粕(46%CP)膨化豆粕乳清粉魚粉蔗糖玉米油石粉磷酸氫鈣食鹽膽堿多維*多礦〔合計(jì)60.0011.0015.005.004.002.000.500.800.850.200.100.050.50100粗蛋白CP(%)賴氨酸(%)鈣(%)總磷(%)消化能(MJ/kg)---------18.731.160.950.5113.95---------

*每kg配合飼料提供Supplied the followings per kg of diets：VA10 000 IU：VD32 000 IU；VE100 IU；VK32 mg；VB12 mg；VB26 mg；VB1212 μg；Niacin 30 mg；Folic acid 0.7 mg；D-pantothenic acid 15 mg；Biotin 0.5 mg；Fe 100 mg；Cu 40 mg；Zn 100 mg；Mn 30 mg；Se 0.3 mg；I 0.2 mg。(消化能為計(jì)算值，其余為測(cè)定值)。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)豬在保育舍飼養(yǎng)，粉料飼喂，自由采食和飲水，試驗(yàn)期為21 d。按常規(guī)飼養(yǎng)管理方法進(jìn)行。分別于試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)空腹稱重，記錄每頭豬體重；在第3、10、21天，全部試驗(yàn)豬空腹前腔靜脈采血5 mL，制備血清，-20℃保存待檢。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.5.1 生長性能 記錄每天飼料消耗量，計(jì)算全期的ADG(平均日增重)、ADFI(平均日采食量)和F/G(料重比)。

1.5.2 血液生化指標(biāo)的測(cè)定方法 總蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、葡萄糖(Glucose，GLU)使用東芝120生化檢測(cè)儀檢測(cè)；皮質(zhì)醇(Cortisol，COR)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)使用XH6080放免儀檢測(cè)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；免疫球蛋白A、G、M試劑盒購自北京金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件的ONE-WAY 單因素方差分析，以Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，\%P\%<0.05為差異顯著。結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 Diquat對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

從表2可以看出，與對(duì)照組相比，處理組的ADFI和ADG顯著降低(\%P\%<0.05)， F/G有提高趨勢(shì)但差異不顯著(\%P\%>0.05)。

表2 Diquat對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同的小寫字母表示差異顯著(\%P<\%0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(\%P>\%0.05)。下表同。

2.2 Diquat對(duì)仔豬血液生化指標(biāo)的影響

由表3可以看出，注射后第3天對(duì)照組和處理組間血液ALT、AST無顯著差異(\%P>\%0.05)；注射后第10天試驗(yàn)組血液ALT、AST提高了17.71%和15.54%；注射后第21天，處理組血液ALT、AST顯著高于對(duì)照組(\%P<\%0.05)。

2.3 Diquat對(duì)仔豬血液氧化指標(biāo)的影響

從表4可以看出，試驗(yàn)第3、10、21 d，處理組血液COR含量均顯著高于對(duì)照組(\%P<\%0.05)，血液GSH-Px均顯著低于對(duì)照組(\%P<\%0.05)。

表3 Diquat對(duì)仔豬血液生化指標(biāo)的影響

表4 Diquat對(duì)仔豬血液氧化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 Diquat對(duì)仔豬生長性能的影響

消化道是動(dòng)物消化、吸收和代謝的主要器官，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，破壞生物膜，影響細(xì)胞的正常生理功能，誘發(fā)消化道疾病，致使消化道腺體分泌異常、腸道損傷及腸粘膜通透性升高和腸源性感染，動(dòng)物表現(xiàn)出采食量下降，生產(chǎn)性能降低。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激通過破壞細(xì)胞之間的緊密連接，引起水和大量離子由腸黏膜進(jìn)入腸腔內(nèi)，誘發(fā)腹瀉。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，注射Diquat 30 min后所有試驗(yàn)豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉的癥狀，三天后基本恢復(fù)正常，氧化應(yīng)激顯著降低了仔豬的ADFI和ADG，降低了仔豬的生長性能。

3.2 Diquat對(duì)血液生化指標(biāo)的影響

Diquat的靶器官是動(dòng)物肝臟。血液ALT 、AST的水平反映肝細(xì)胞的損傷程度。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷或發(fā)生病變時(shí)，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性遭到破壞，其內(nèi)部的ALT、AST釋放并大量進(jìn)入血液，引起血液ALT、AST 含量升高，而肝臟組織中兩種酶的活性下降，因此血液中ALT、AST升高可作為肝臟功能受損或病變的敏感指標(biāo)。王轉(zhuǎn)丁等研究發(fā)現(xiàn)，游泳應(yīng)激30 min、50 min 后小鼠血液ALT 和AST顯著升高，之后有所下降但仍高于游泳前水平，說明游泳應(yīng)激可能造成小鼠肝臟損傷，血液ALT和AST可作為評(píng)價(jià)小鼠應(yīng)對(duì)游泳應(yīng)激的敏感指標(biāo)。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果一致，Diquat顯著提高了血液ALT和AST水平，對(duì)仔豬肝臟造成了損傷，造成氧化應(yīng)激。而試驗(yàn)前期ALT、AST均處于一個(gè)較高水平且差異不顯著，這可能與仔豬斷奶應(yīng)激有關(guān)，朱夢(mèng)玲等研究表明，仔豬斷奶后血液ALT、AST水平顯著升高，試驗(yàn)中后期ALT、AST活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明仔豬逐漸適應(yīng)斷奶應(yīng)激。

3.3 Diquat對(duì)血液抗氧化指標(biāo)的影響

GSH-Px是動(dòng)物體內(nèi)的天然自由基清除劑，可以催化H2O2和脂質(zhì)過氧化物還原，在抗氧化損傷和維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)方面起著重要的作用。劉曉慧等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠巨噬細(xì)胞氧化損傷模型中GSH-Px活性顯著低于正常細(xì)胞。COR是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一種糖皮質(zhì)激素，主要作用是調(diào)節(jié)體內(nèi)糖和蛋白質(zhì)的代謝。馬文濤等研究表明，應(yīng)激組大鼠血清COR含量顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Diquat能顯著降低GSH-Px活性，增加血液COR含量，降低了仔豬抗氧化能力，使仔豬處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。

3.4 Diquat誘導(dǎo)的仔豬氧化應(yīng)激模型

本試驗(yàn)綜合仔豬生產(chǎn)性能、血液生化指標(biāo)可知，通過一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可有效誘導(dǎo)仔豬發(fā)生氧化應(yīng)激，建立穩(wěn)定的氧化應(yīng)激模型。袁施彬等研究發(fā)現(xiàn)，給仔豬一次性腹腔注射12 mg/kg Diquat溶液后第49 d的血清抗氧化酶活力及免疫指標(biāo)仍顯著低于對(duì)照組，表明應(yīng)激持續(xù)了49 d。徐靜等研究表明，給生長豬一次性腹腔注射8 mg/kg Diquat溶液后氧化應(yīng)激效應(yīng)可持續(xù)約28 d，到第35 d時(shí)，應(yīng)激效應(yīng)基本消除。本試驗(yàn)中，仔豬在注射Diquat后的3周內(nèi)均處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，說明應(yīng)激效應(yīng)時(shí)間可持續(xù)21 d以上。

4 結(jié)論

給斷奶仔豬一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，建立仔豬氧化應(yīng)激模型，應(yīng)激效應(yīng)可持續(xù)21d以上；血清中ALT、AST、GSH-Px和COR可作為評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的敏感指標(biāo)。

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LIU Tong1, LI Ze-qing2, YAN Jun3,4,*, LI Ning1, MU Shu-qin3,4, LI Chi1,

MA Yong3,4, WANG Wen-jie3,4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnologyNorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2TianjinBaodiDevelopmentServicecenterofLivestockandAquaculture,Tianjin301800; 3.TianjinInstituteofAnimalhusbandryandveterinary,Tianjin300381,China; 4.TianjinTechnologyEngineeringCenterofLivestockandPoultryhealthyhusbandry,Xiqing,Tianjin300381,China)

This study was to observing growth performance, serum biochemical and antioxidant level of weaned pigs after intraperitoneal injected Diquat, verify whether oxidative stress model was successfully constructed and further evaluate sensitive indicator of oxidative stress.Thirty 10.60±1.10 kg weaned pigs were randomized in two groups, each group has 3 replicates with 5 piglet, the treated group intraperitoneal injected Diquat 10 mg/kg, the control group was injected with the same dose of sterile saline.Trial period 21d, in the 3, 10, 21 days of fasting before venous blood sampling and test serum biochemical and antioxidant indices.The results showed that, Diquat significantly reduce pig’s ADG and ADFI (\%P\%<0.05), significantly increased serum ALT, AST activity and COR level (\%P\%<0.05), significantly reduce serum GSH-Px vitality (\%P\%<0.05).The study showed that intraperitoneal injection of 10 mg/kg Diquat in weaned pigs can induce oxidative stress, stress reaction can retain 21d above, serum ALT, AST, GSH-PX vitality and COR levels can be as stress-sensitive indicators.

Diquat; weaned piglets; oxidative stress; model

2016-08-29

十二五農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃(2012BAD39B01-3)；博士后基金(2014M561191)；天津市農(nóng)科院院長基金 (15001)。

劉通(1992-)，男，遼寧大連人，碩士，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)研究。E-mail:173148612@qq.com。

*[通訊作者] 閆峻(1984-)，江蘇徐州人，博士，主要從事單胃動(dòng)物營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖技術(shù)研究。E-mail:yjjsxz@163.com。

S 828.8

A

1004-6704(2016)06-0061-03