鄭秀茜，房　城，劉永武，賈博宇（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

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HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地淫羊藿藥材中兩種黃酮類(lèi)化合物的含量

鄭秀茜，房城，劉永武，賈博宇
（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

摘要：目的：建立HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地淫羊藿藥材中淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι成分含量的方法。方法：色譜柱：AgilentZorbaxSB-C18柱，流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，流速為1.0mL·min-1。結(jié)果：淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι成分的線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性范圍分別為0.800～45.00，0.550～24.90mg·L-1；加樣回收率分別為96.85%、98.16%，RSD分別為0.45%、1.28%（n=6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι為淫羊藿藥材中特征性成分，可作為指標(biāo)性成分用于淫羊藿藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：HPLC；淫羊藿；淫羊藿苷；淫羊藿屬苷Ⅰ

淫羊藿（Epimediumbrevicornu Maxim）為小檗科植物的干燥葉。三出復(fù)葉，先端微尖，葉片近革質(zhì)。氣微，味微苦。具有補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕等作用。用于腎陽(yáng)虛衰，陽(yáng)痿遺精等癥［1］。主產(chǎn)于四川，甘肅，寧夏，東北等地。該藥材中黃酮含量最高［2］，是其主要作用成分。2015年版《中國(guó)藥典》中以淫羊藿苷的含量作為該藥材質(zhì)量鑒別的指標(biāo)性成分，其要求淫羊藿苷不得少于0.50%.然而市售藥材中淫羊藿苷基本不符合藥典要求。因此，應(yīng)對(duì)淫羊藿進(jìn)行多方面考察，檢測(cè)淫羊藿苷的同時(shí)，應(yīng)增加成分測(cè)定作為淫羊藿藥材質(zhì)量控制的新指標(biāo)。本文通過(guò)對(duì)50批主要產(chǎn)地、不同批次的淫羊藿中淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι的含量情況進(jìn)行分析測(cè)定，可以為淫羊藿藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試藥

Aglient 1290高效液相色譜工作站；Aglient 1290高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；FA2004型分析天平（上海良平儀器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

淫羊藿苷與epimedokoreanoside I均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室自制，通過(guò)核磁共振譜鑒定結(jié)構(gòu)，采用面積歸一化法計(jì)算出化合物純度大于98.56%。色譜級(jí)乙腈、甲醇（天津市康科德科技有限公司，批號(hào)：141008）；娃哈哈純凈水；分析純乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。50批來(lái)自國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地的淫羊藿藥材。

1.2色譜條件和系統(tǒng)適用性

色譜柱：Agilent ZorbaxSB-C18柱（5 μm，250mm ×4.6mm，）；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；進(jìn)樣體積：5μL；體積流量：1.0mL·min-1；柱溫：25±0.15℃；流動(dòng)相系統(tǒng)如下表所示A：乙腈；B：水。理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)不低于10000，相鄰兩色譜峰之間的分離度應(yīng)不小于1.5，拖尾因子應(yīng)大于0.95，并且小于1.05。

表1　流動(dòng)相系統(tǒng)Tab.1 Gradient elution program for HPLC

1.3溶液的制備

1.3.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι適量，加甲醇溶解制成對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.401、0.508g·L-1的對(duì)照品溶液。

1.3.2樣品溶液的制備將藥材粉碎，過(guò)三號(hào)篩，于分析天平精密稱(chēng)取粉末0.2g，倒入具塞三角瓶中，加入稀乙醇20mL稱(chēng)重，經(jīng)超聲1.5h后，補(bǔ)足超聲過(guò)程中損失的重量，搖勻提取液，經(jīng)0.25μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2　結(jié)果與討論

2.1線(xiàn)性范圍考察

按1.2項(xiàng)下色譜條件，由低濃度到高濃度順序?qū)煞N對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，測(cè)定得到峰面積。得到線(xiàn)性回歸方程，見(jiàn)表2。

表2　線(xiàn)性回歸方程Tab.2 Results of regression equation

以上結(jié)果表明：淫羊藿苷、epimedokoreanoside I在如表所示的范圍呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2精密度考察

任取一份淫羊藿藥材，制備成供試品溶液按1.2項(xiàng)下色譜條件、2.1.2項(xiàng)下制備方法，進(jìn)樣6次，測(cè)定淫羊藿苷的色譜峰面積，其RSD值為0.25%，小于3.0%，該結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用儀器及方法具有良好的精密度，符合要求。

2.3穩(wěn)定性考察

任取一份淫羊藿藥材，制備成供試品溶液按1.2項(xiàng)下色譜條件，1.3項(xiàng)下制備方法，分別在第0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣分析，測(cè)定出淫羊藿苷的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值為0.46%，測(cè)定結(jié)果證實(shí)供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4重復(fù)性考察

按1.2項(xiàng)下色譜條件、1.3項(xiàng)下制備方法，取淫羊藿藥材，制備6份相同樣品供試品溶液，測(cè)定出化合物淫羊藿苷的峰面積，峰面積的RSD值為0.37%，表明本實(shí)驗(yàn)方法具有良好的重復(fù)性。

2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)

按1.2項(xiàng)下色譜條件、1.3項(xiàng)下制備方法，取6份已知含量的淫羊藿藥材，每份0.1g于具塞錐形瓶中。向每組中分別加對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣分析?；厥章式Y(jié)果如表3所示。

表3　加樣回收率Tab.3 Results of recoveries test（n=6）

2.4含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了來(lái)自4個(gè)地區(qū)分別為四川、甘肅、寧夏、東北等地的淫羊藿藥材中淫羊藿苷及Epimedokoreanoside I的含量，進(jìn)行對(duì)比。供試品溶液按樣品溶液配制方法制備，按1.2條件測(cè)定，用外標(biāo)一點(diǎn)法得出含量，見(jiàn)表4。

3　結(jié)論

淫羊藿中淫羊藿苷的含量差異較大，大部分藥材低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。50批次藥材中受產(chǎn)地、種系、時(shí)間影響，因環(huán)境等因素均不相同，是造成淫羊藿藥材質(zhì)量差異的主要原因。

本文對(duì)50批不同產(chǎn)地藥材中淫羊藿苷及Epimedokoreanoside I進(jìn)行了含量測(cè)定，其中Epimedokoreanoside I測(cè)定結(jié)果在0.11%～0.01%范圍內(nèi)，初步擬定藥材中Epimedokoreanoside I的含量不低于0.01%，可與淫羊藿苷同作為淫羊藿藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)。測(cè)定多種黃酮類(lèi)成分指標(biāo)用于淫羊藿的質(zhì)量標(biāo)評(píng)價(jià)體系，將epimedokoreanoside Ι作為藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)之一，用以評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。

表4　50批藥材中淫羊藿苷、epimedokoreanoside Ι的含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Contents of Icariin and Epimedokoreanoside Ι in 50samples（%）

參考文獻(xiàn)

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.327.

［2］蔣俊,崔麗等.基于淫羊藿黃酮類(lèi)化合物的體內(nèi)代謝闡述其抗骨質(zhì)疏松藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［J］.中草藥，2014，45（5）:721-729.

［3］孟寧,孔凱,李師翁.淫羊藿屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.西北植物學(xué)報(bào),2010,30（5）:1063-1073.

Simultaneous determination of 2 flavonoids in Epimedium by HPLC

ZHENG Xiu-xi，F(xiàn)ANG Cheng，LIU Yong-wu，JIA Bo-yu
（Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract：Objective: To develop a method for the quantitative analysis of icariin, epimedokoreanoside I，totally 2 flavonoids in Epimedium. Methods: The analysis was performed by using a Zorbax SB-C18analytical column （250mm×4.6mm, 5μm）at gradient elution of acetonitrile and water with diode-array detection（270nm）, the flow rate was 1.0mL·min-1. Results: All calibration curves showed good linearity within test ranges. The recoveries were 96.85%、98.16%and the RSD f were0.45%、1.28%（n=6）. Conclusions: This method is reliable, simple and reproducible. It can be used for the determination method of Epimedium. icariin, epimedokoreanoside I was indeed the specific ingredient in epimedium herbs, the method able and sensitive for quality control of Epimedium herbs, and can be used as indicators of the quality control Epimedium medicinal ingredients.

Key words:HPLC；Epimedium；icariin，epimedokoreanoside I

中圖分類(lèi)號(hào)：R28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160533

收稿日期：2016-03-28

作者簡(jiǎn)介：鄭秀茜（1987-），女，黑龍江省哈爾濱市，碩士，研究實(shí)習(xí)員。

通訊作者：賈博宇（1977-），女，博士，副研究員，研究方向：中藥抗衰老、抗腫瘤的藥效學(xué)研究。