孫會會，仲建軍（山東省德州市公安局，山東德州253000）

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LC-MS/MS同時分析血液中8種苯二氮卓類藥物

孫會會，仲建軍
（山東省德州市公安局，山東德州253000）

摘要：建立LC-MS/MS同時對血液中8種苯二氮卓類藥物進行定性定量分析的方法。采用島津LC-20AD高效液相色譜儀與AB Sciex3200 Q TRAP質譜儀聯(lián)用法，Phenomenex C18色譜柱，高純水-乙腈作為流動相進行梯度洗脫。8種化合物的線性范圍0.5～200ng·mL-1，相關系數(shù)均高于0.998；8種化合物的檢測限（S/N≥3）均低于0.3ng·mL-1。方法重現(xiàn)性好，準確度高，可用于強奸、搶劫、殺人等案件的血液檢材中苯二氮卓類藥物的定性定量分析。

關鍵字：LC-MS/MS；血液；苯二氮卓類

苯二氮卓類（Benzodiazepines）是一類中樞神經系統(tǒng)藥物，臨床常見的有安定（地西泮）、阿普唑侖、三唑侖、艾司唑侖等，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗癲癇、肌肉松弛和安定作用。作為安眠鎮(zhèn)靜類藥物，在近幾年常被犯罪分子用于麻醉搶劫、強奸、殺人，引起了公安部門的高度重視。

測定血液中苯二氮卓類藥物多采用氣相色譜質譜聯(lián)用法（GC-MS）、液相色譜質譜聯(lián)用法（LC-MS）。傳統(tǒng)利用GC-MS測定血液中苯二氮卓類鎮(zhèn)靜安眠藥采取的是衍生化方法，比較繁瑣，使用的有機試劑毒性大。LC-MS可以檢驗難氣化，沸點高的化合物，前處理方法簡單，樣品檢驗的范圍廣，儀器靈敏，選擇性好，無需進行衍生化，適宜進行苯二氮卓類化合物的檢測。

本文建立了血液中8種苯二氮卓類藥物的高效液相色譜-四級桿離子阱串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）檢驗方法，采用多反應監(jiān)測模式（MRM），選取兩對離子對分析，該方法簡單快捷，重現(xiàn)性好，精密度高，適宜應用于法醫(yī)臨床毒物的篩查和定量檢測。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

島津LC-20AD高效液相色譜儀；ABSciex3200 QTRAP質譜儀；TGL-16C離心機（上海安亭科學儀器廠）；VORTEX-GENIE2渦輪振蕩器（Scientific Industries）；BSA-323S電子天平（德賽多利斯）；容量瓶；移液槍（上海華運分析儀器有限公司）；有機微孔濾膜（0.22μm）。

乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；高純水；安定（地西泮）、阿普唑侖、氯硝安定、艾司唑侖（舒樂安定）、三唑侖、利眠寧（氯氮卓）、咪噠唑侖、硝安定標準品均購自公安部，純度均大于99.1%。

安定（地西泮）、阿普唑侖、氯硝安定、艾司唑侖（舒樂安定）、三唑侖、利眠寧（氯氮卓）、咪噠唑侖、硝安定配置成濃度1μg·mL-1的標準儲備液。

1.2樣品處理

在1mL的血樣中加入3mL乙腈，振蕩10min，在轉速5000r·min-1下離心15min，取上清液，經微孔濾膜過濾，備檢。

1.3色譜條件

色譜柱：PhenomenexC18柱（50mm×2mm,2.5μm），柱溫：40℃，進樣量1μL，流速0.6mL·min-1，高純水-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Tab.1 The program of gradient elution

1.4質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描（ESI+）；檢測方式：MRM；離子噴射電壓（IS）：5500V；碰撞氣N2（CAD）:Medium；氣簾氣（CUR）：20psi；離子源氣Gas1：15psi；離子源氣Gas2：15psi；離子源溫度：500℃。

表2　8種苯二氮卓類藥物LC-MS/MS條件Tab.2 LC-MS/MS conditions for 8 benzodiazepines

2　結果與討論

2.1定性與定量條件

每種化合物選取了兩對離子對進行定性分析，利用其中一對離子對進行定量分析。每種化合物選取的離子對、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）如表2所示。

2.2色譜柱的選擇

色譜柱是HPLC的心臟。本文選擇了不同粒徑、不同長度和不同柱徑的色譜柱進行比較。由于苯二氮卓類目標物極性較弱，故采用C18反相色譜柱；實驗結果表明，較細的柱粒徑有助于提高分離分析效率，但會導致柱壓升高；長色譜柱有利于增加分離度，但延長了分離時間，增加了時間成本。綜合以上因素，結合各種化合物的分離情況以及苯二氮卓類藥物的性質，選擇PhenomenexC18色譜柱（50mm× 2mm,2.5μm）作為本實驗的色譜柱。

2.3流動相的選擇

乙腈的溶劑強度比較高，粘度較小。實驗中分別選擇乙腈和甲醇作為有機相進行考察，發(fā)現(xiàn)當選擇乙腈作為流動相時，各種化合物的分離效果比較好。同時考慮到實驗的前處理用乙腈作為沉淀劑，沉淀血液中的蛋白，所以本次實驗選擇乙腈作為有機相。

實驗中考察等度洗脫對分離的效果，分別實驗了10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%乙腈-水溶液進行等度洗脫，但是分離效果不好，化合物色譜峰出現(xiàn)交叉或重疊，所以實驗選擇梯度洗脫。

2.4標準曲線、線性范圍和方法檢測限

選擇每種化合物響應最強的離子對進行定量分析。將實驗中的8種苯二氮卓類藥物添加到空白血中，配制成一系列不同濃度的溶液，確定每種化合物的線性范圍，以便于定量檢測。每種化合物的性質不一樣，離子化的效率有差異，所以其檢出限也不同，以S/N≥3為標準確定檢出限。結果見表3。

表3　8種苯二氮卓類藥物的線性范圍與檢出限Tab.3 Linear range and LOD of 8 benzodiazepines

2.5精密度與回收率

取空白血樣，加入8種所測化合物的標準品溶液，配制成濃度分別為0.5、2、10、20、50ng·mL-1的標準添加工作液，每種濃度分別平行測定6次，連續(xù)測定6d，測得每種化合物的日內精密度（RSD%）均小于3.2%，日間精密度（RSD%）均小于5.1%。

取空白血樣，加入8種所測化合物的標準品溶液，配置成濃度分別為0.5、10、50ng·mL-1的標準添加工作液，每種濃度平行測定3份，計算每種化合物的回收率。實驗結果表明，利用乙腈沉淀蛋白，重現(xiàn)性好，每種物質的回收率都在80%以上。

2.6案例應用

2015年3月，某縣公安局送檢強奸致人死亡案件中被害人的靜脈血一份，要求進行毒物成分定性定量分析，應用實驗中建立的LC-MS/MS方法，檢測出檢材血中含有安定和艾司唑侖成分，含量分別為61和24ng·mL-1。譜圖見圖1～3。

圖1　安定、艾司唑侖的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of diazepam and estazolam

圖2　安定的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of diazepam

圖3　舒樂安定的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of estazolam

3　結語

本文建立了8種苯二氮卓類藥物的LC-MS/MS的檢驗方法，可以準確對每種化合物進行定性定量分析，該方法具有很好的重現(xiàn)性和準確性，為公安部門偵破苯二氮卓類藥物相關案件提供了很好的技術支持。

參考文獻

［1］汪麗萍,趙海鄉(xiāng),邱月明.硝西泮、氯硝西泮甲基衍生物的氣相色譜-質譜分析［J］.分析測試學報，2005,24（6）:47-51.

［2］卓曉聰,謝瑜,褚建新.五氟丙酰衍生化-氣相色譜/質譜聯(lián)用法分析尿液中7-氨基硝西泮［J］.法醫(yī)學雜志，2007,23（3）: 199-200.

［3］沈寶華,沈敏,卓先義，等.尿液中苯駢二氮卓類藥物篩選分析研究法［J］.醫(yī)學雜志，2002,18（1）:22-25.

［4］劉偉,沈敏,沈寶華，等.LC-MS/MS-MRM篩選血液中22種有毒生物堿成分［J］.法醫(yī)學雜志，2007,23（5）:349-351.

［5］嚴慧,向平,卜俊，等.液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測血液中的美西律［J］.法醫(yī)學雜志，2007,23（6）:441-443.

Simultaneous analysis of 8 benzodiazepines in blood by LC-MS/MS

SUN Hui-hui，ZHONG Jian-jun
（Dezhou Public Security Bureau of Shandong Province, Dezhou 25300, China）

Abstract：A qualitative and quantitative method was established for detection of 8 benzodiazepines in blood by LC-MS/MS. The HPLC system was with Shimadzu LC-20AD pump and coupled to AB Sciex 3200 Q TRAP mass. Chromatographic separation was achieved by a Phenomenex C18 column（50mm×2mm, 2.5μm）. Water（A）and and acetonitrile（B）were used as mobile phase for gradient elution. The correlation coefficient of all the analytes were over 0.998 in the linear range of 0.5～200ng·mL-1, and the LODs were below 0.3ng/mL. This method was rapid, reliable and highly accuracy for qualitative and quantitative analysis of 8 benzodiazepines in blood concerning rape, rob or murder cases.

Key words：LC-MS/MS；blood；benzodiazepines

中圖分類號：O657.72；S859.81

文獻標識碼：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160530

收稿日期：2015-12-24

作者簡介：孫會會（1987-），女，碩士研究生，助理工程師，2012年畢業(yè)于中國科學技術大學分析化學專業(yè)?，F(xiàn)從事毒物、毒品分析工作。