王建　程雪嬌　焦曉軍　余貴菊　于小婷　王猛　曾振靈　曾東平

摘 要：為了科學(xué)、客觀地評價(jià)干乳期利福昔明乳房注入劑在奶牛臨床上應(yīng)用的安全性，根據(jù)相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則，分別進(jìn)行家兔的皮膚刺激性試驗(yàn)、陰道刺激性試驗(yàn)及豚鼠主動皮膚過敏性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，利福昔明乳房注入劑給藥部位的皮膚和生理鹽水對照組都沒有出現(xiàn)紅斑和水腫，刺激強(qiáng)度的評分為0分；陰道刺激試驗(yàn)的試驗(yàn)組和對照組的陰道粘膜沒有出現(xiàn)明顯的白細(xì)胞浸潤、充血和水腫現(xiàn)象，陰道粘膜刺激指數(shù)為0.25；在皮膚過敏性試驗(yàn)中，給藥組動物皮膚未見紅斑與水腫，各時(shí)間的皮膚刺激反應(yīng)積分為0。因此，利福昔明乳房注入劑對家兔的皮膚和陰道無刺激性；對豚鼠不產(chǎn)生明顯的皮膚過敏性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：利福昔明乳房注入劑；皮膚刺激；陰道刺激；主動皮膚過敏反應(yīng)

中圖分類號：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.006

Study on LocalIrritation and Allergy Tests of Rifaximin Breast Implants

WANG Jian1， CHENG Xuejiao1， JIAO Xiaojun1， YU Guiju1， YU Xiaoting1，WANG Meng1， ZENG Zhengling2，ZENG Dongping2

（1. Tianjin Speerise Challenge Biotechnology Company Limited，Tianjin 300380，China；2. College of Veterinary Medicine， South China Agriculture University， Guangzhou 510640，China）

Abstract： In order to scientifically and objectively evaluate the safety of cows clinical application of rifaximin breast implants in the dry period， referring to the relevant technical specifications， rabbit skin irritation test， vaginal mucous membrane irritation test and guinea pig skin allergy test respectively was studied. The results showed that erythema and edema was not been found on rifaximin breast implants administration site skin and saline control site skin， and score of 0 points. In the vaginal mucous membrane irritation test， leukocyte infiltration， hyperemia and edema was not been found obviously in vaginal mucosa of test group and control group， vaginal mucous membrane irritation index was 0.25. In the skin allergy test， erythema and edema was not been found on test group， skin irritation in each time integral was 0. So， rifaximin breast implants had no irritation on rabbit skin and vaginal mucous membrane； guinea pigs do not produce significant allergic skin reaction after administration.

Key words： rifaximin breast implants； skin irritation； vaginal mucous membrane irritation； skin allergic reaction

利福昔明（rifaximin）是利福霉素的半合成衍生物，和其他利福霉素類抗生素類似，利福昔明通過和細(xì)菌DNA-依賴RNA聚合酶的β-亞單位發(fā)生不可逆的結(jié)合從而抑制細(xì)菌RNA的合成，防止了該酶與DNA連接，阻斷RNA轉(zhuǎn)錄并最終抑制了細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，本品抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，對多種革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌、鏈球菌和棒狀桿菌）、革蘭陰性菌（大腸桿菌、巴氏桿菌、假單胞菌和變形桿菌等）均有高度抗菌活性[1-3]。目前，歐盟已批準(zhǔn)利福昔明用于干乳期奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的治療，歐盟規(guī)定利福昔明在牛奶中的殘留標(biāo)示物為原形藥物，最高殘留限量（MRL）為60 μg·kg-1。

利福昔明乳房注入劑（干乳期）是天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司研制的新獸藥，用于預(yù)防由金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌引起的干奶期奶牛乳房炎。為了科學(xué)、客觀評價(jià)天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司研制的干乳期利福昔明乳房注入劑在奶牛臨床上應(yīng)用的安全性，現(xiàn)根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于發(fā)布藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則等8項(xiàng)技術(shù)指導(dǎo)原則的通告（2014年第4號）附件4《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]，及中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告（第1247號）頒布的《獸藥臨床前毒理學(xué)評價(jià)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[5]，分別進(jìn)行了家兔的皮膚刺激性試驗(yàn)、陰道刺激性試驗(yàn)以及豚鼠主動皮膚過敏性試驗(yàn)，對其進(jìn)行臨床前毒理學(xué)評價(jià)，預(yù)測臨床用藥的安全性，為臨床試驗(yàn)提供參考。endprint

1 材料和方法

1.1 供試藥品

利福昔明乳房注入劑（干乳期）：規(guī)格5.0 mL∶100 mg（以利福昔明計(jì)），批號120810，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司。

陽性對照藥：2，4-二硝基氯苯，規(guī)格25 g，批號20130726，由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供。

陰性對照藥：0.9%氯化鈉注射液，規(guī)格500 mL：4.5 g，批號A10082202，由貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)動物

新西蘭兔，普通級，體重2 kg左右，雌雄各半，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SCXK（粵）2011-0015]。FMMU豚鼠，普通級，雌雄各半，體質(zhì)量300 g左右，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SCXK（粵）2011-0015]。動物購回后環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)3 d，采用自然光照，試驗(yàn)期間飼喂全價(jià)兔料，飲水充足、不受限制，室溫控制在26 ℃，相對濕度為40%～70%。

1.3 試驗(yàn)方法

依據(jù)相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則中的皮膚刺激性試驗(yàn)、陰道刺激性試驗(yàn)和主動皮膚過敏性試驗(yàn)方法[4-6]進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.1 皮膚刺激性試驗(yàn) 將8只新西蘭兔隨機(jī)分為完整皮膚組（Ⅰ組）和破損皮膚組（Ⅱ組）兩組，每組4只，雌雄各半。Ⅰ組試驗(yàn)開始前24 h將動物脊柱兩側(cè)對稱部位用電動剃毛器各剃出面積為3 cm×3 cm的無毛區(qū)，將試驗(yàn)動物皮膚脫毛后，檢查去毛區(qū)域是否有因去毛而導(dǎo)致的受傷，受傷皮膚不宜再進(jìn)行刺激性試驗(yàn)。Ⅱ組破損皮膚是用7號針頭（一次性消毒）按“#”字形劃破已去毛消毒皮膚的表皮層，以出現(xiàn)滲血為標(biāo)準(zhǔn)，左右兩側(cè)皮膚的破損程度應(yīng)基本保持一致。左側(cè)為利福昔明乳房注入劑用藥區(qū)，取0.5 mL涂布于左側(cè)已經(jīng)去毛的皮膚上，然后用紗布（2.5 cm×2.5 cm）和一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激性膠布固定，右側(cè)為生理鹽水對照區(qū)，貼敷時(shí)間為5 h，之后去掉受試物，用溫水清洗用藥部位的皮膚，連續(xù)用藥3 d。在每次去除藥物后1 h及再次貼敷前，仔細(xì)觀察并記錄紅斑及水腫、涂敷部位是否有色素沉淀、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況及其發(fā)生時(shí)間及消退時(shí)間，并參照皮膚刺激性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分（表1），采用同體左右側(cè)自身對比。最后一次貼敷后，在去除藥物后30～60 min，24，48，72 h各時(shí)間點(diǎn)來觀察并記錄是否有紅斑和水腫等情況出現(xiàn)在涂敷部位。對評分較高或可疑的受試動物處死1只，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，并根據(jù)皮膚刺激性強(qiáng)度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和病理學(xué)檢查綜合判定結(jié)果。多次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn)，先計(jì)算每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)的各組積分均值，再計(jì)算觀察期限內(nèi)的每天每只動物積分均值，并按照表2進(jìn)行刺激強(qiáng)度評價(jià)。

1.3.2 陰道刺激性試驗(yàn) 8只雌性新西蘭兔隨機(jī)分為攻毒試驗(yàn)組和正常對照組兩個(gè)組，每組4只。往攻毒試驗(yàn)組的陰道灌注2 mL的利福昔明乳房注入劑，往對照組動物的陰道灌注2 mL的生理鹽水。攻毒后24 h，各組新西蘭兔用空氣栓塞法安樂處死，用手術(shù)剪剪開腹盆腔取出完整的陰道，縱向剖開，觀察是否出現(xiàn)充血、水腫等病理現(xiàn)象，將出現(xiàn)充血、水腫等病理現(xiàn)象的陰道放入10%的福爾馬林溶液中固定24 h以上，然后取陰道的兩端和中央三個(gè)部位的組織制作病理切片，HE染色后，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。然后按粘膜刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分（表3），最后分值為每組的每一個(gè)觀察時(shí)間每一動物的粘膜刺激反應(yīng)分值相加得到的總積分除以這組的動物數(shù)。按粘膜刺激強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行刺激強(qiáng)度分級（表4）判斷其刺激程度。

1.3.3 主動皮膚過敏性試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用同體自身對比法，致敏期間左側(cè)給予利福昔明乳房注入劑，激發(fā)給藥于右側(cè)皮膚。取30只豚鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為陰性對照，陽性藥物對照（2，4-二硝基氯苯）和利福昔明乳房注入劑3組，分別為1組，2組，3組。每組各10只豚鼠。致敏給藥和激發(fā)給藥分別于試驗(yàn)動物的左、右側(cè)皮膚進(jìn)行。致敏給藥：在動物左側(cè)脫毛區(qū)涂抹0.2 mL受試物，用醫(yī)用薄紗布覆蓋并固定住，以防止動物啃咬、損傷用藥部位，保持6 h，并在第7 天和第14 天，重復(fù)上述試驗(yàn)，陰性對照組（生理鹽水）與陽性藥物對照組（0.1%的2，4-二硝基氯苯）的試驗(yàn)方法同致敏試驗(yàn)一致。激發(fā)給藥：于末次給受試物致敏后14 d，在豚鼠背部右側(cè)脫毛區(qū)涂抹0.2 mL受試物，6 h后去掉受試物并馬上觀察皮膚的過敏反應(yīng)情況，并在24，48，72 h再次觀察上述現(xiàn)象，并按表5對紅斑和水腫進(jìn)行評分，計(jì)算過敏反應(yīng)的發(fā)生率，根據(jù)表6判斷過敏反應(yīng)發(fā)生程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚刺激性試驗(yàn)

每日觀察新西蘭兔在3 d給藥期及給藥結(jié)束后3 d內(nèi)的給藥部位皮膚情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示出，利福昔明乳房注入劑在完整皮膚組和破損皮膚組的給藥部位和對照部位（生理鹽水）均未出現(xiàn)紅斑和水腫現(xiàn)象，根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)評為0分；也沒有發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象如藥源性出血，色素沉淀以及皮膚粗糙。并且試驗(yàn)動物其他生理現(xiàn)象（飲水、飲食、排泄、外觀、重量）也沒有出現(xiàn)異常。根據(jù)國家有關(guān)皮膚刺激性試驗(yàn)皮膚反應(yīng)評分及反應(yīng)強(qiáng)度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)原則，利福昔明乳房注入劑（干乳期）對新西蘭兔的完整皮膚和破損皮膚，均無刺激性反應(yīng)，結(jié)果見表7。

2.2 陰道刺激性試驗(yàn)

用藥期間，攻毒試驗(yàn)組和正常對照組家兔的全身狀況均沒有發(fā)現(xiàn)異常，陰道口也沒有出現(xiàn)明顯充血、紅腫及異常分泌物流出。解剖并取出陰道組織進(jìn)行肉眼觀察，攻毒試驗(yàn)組的陰道有輕微的粘膜充血、水腫以及出血點(diǎn)現(xiàn)象，陰道粘膜刺激平均分為0.25，依據(jù)國家有關(guān)陰道粘膜刺激反應(yīng)評分及反應(yīng)強(qiáng)度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，利福昔明乳房注入劑對家兔一次性陰道粘膜刺激強(qiáng)度為無刺激性。結(jié)果見表8。組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖1，2。

2.3 主動皮膚過敏性試驗(yàn)

在試驗(yàn)過程中，各組試驗(yàn)動物均未有嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)發(fā)生，如哮喘、站立不穩(wěn)或休克等過敏現(xiàn)象。利福昔明乳房注入劑組在致敏后0，24，48，72 h致敏反應(yīng)的平均值皆為0，空白對照組0，24，48，72 h致敏反應(yīng)的平均分皆為0；陽性對照組2，4-二硝基氯苯致敏和激發(fā)期間均出現(xiàn)紅斑和水腫，0，24，48，72 h致敏反應(yīng)的平均分為5.7，4.6，5.0，5.7，按照國家有關(guān)皮膚過敏反應(yīng)評分及過敏性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，利福昔明乳房注入劑對豚鼠的皮膚為弱致敏性，結(jié)果見表9。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)嚴(yán)格按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的關(guān)于藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則等8項(xiàng)技術(shù)指導(dǎo)原則的通告（2014年第4號）附件4《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，及中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告（第1247號）頒布的《獸藥臨床前毒理學(xué)評價(jià)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》，進(jìn)行家兔皮膚刺激性試驗(yàn)、陰道粘膜刺激性試驗(yàn)和豚鼠的皮膚過敏性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示利福昔明乳房注入劑對家兔的皮膚和陰道粘膜無刺激性；對豚鼠不產(chǎn)生明顯的皮膚過敏性反應(yīng)。提示本品的應(yīng)用安全性良好，臨床使用安全，符合規(guī)范要求，值得臨床上進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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