昌洪濤++朱列書(shū)++彭妙++李安++魯柯佚

摘 要：基于重測(cè)序技術(shù)，對(duì)兩對(duì)不育系和對(duì)應(yīng)的保持系材料的線粒體DNA進(jìn)行重測(cè)序，統(tǒng)計(jì)并分析了不育系與保持系線粒體DNA編碼區(qū)序列的突變位點(diǎn)，探討了這些突變位點(diǎn)與煙草胞質(zhì)不育的關(guān)系。對(duì)重測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析可知：不育系和保持系在orf106b上具有一致的1個(gè)InDel位點(diǎn)，在orf138a、orf121b、orf129b和orf110b上具有一致的SNP位點(diǎn)，這些突變位點(diǎn)沒(méi)有造成不育系與保持系編碼區(qū)序列的差異，推測(cè)這些突變位點(diǎn)可能與CMS無(wú)關(guān)；不育系MSK326和MSK394在orf112a和orf103c上有相同的InDel位點(diǎn)；MSK326和MSK394在65個(gè)基因片段或開(kāi)放閱讀框上有一致SNP位點(diǎn)，且這些突變沒(méi)有出現(xiàn)在保持系線粒體編碼區(qū)。這些基因片段或開(kāi)放閱讀框上的InDel和SNP突變都導(dǎo)致了基因或開(kāi)放閱讀框編碼序列的改變，并且造成了氨基酸的突變，推測(cè)可能與煙草CMS密切的相關(guān)。其中atp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf25、nad6、nad7、orf108、orf239、orf129、sdh4等基因或開(kāi)放閱讀框上的突變位點(diǎn)與報(bào)道研究一致，均被報(bào)道與煙草CMS存在密切的聯(lián)系。本研究所挖掘的這些大量基因片段上的InDel和SNP位點(diǎn)，不僅有助于煙草CMS機(jī)理的進(jìn)一步研究，也為煙草不育系育種研究提供有力的遺傳工具。

關(guān)鍵詞：煙草；線粒體DNA；重測(cè)序

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.001

Re-sequencing Study on the Mitochondrial DNA of Tobacco Sterile Line and Maintainer Line

CHANG Hongtao1，ZHU Lieshu1，PENG Miao2，LI An2，LU Keyi1

（ 1.College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China； 2. College of Biological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128， China）

Abstract：Based on the technology of re-sequencing in this study， resequencd the mitochondrial DNA of two pairs of tobacco material of sterile line and maintainer line， statisticed analyzed the differences in mitochondrial DNA sequence of sterile line and maintainer line， discussed the relationship between the mutation site and CMS. For the comparison analysis of resequencing date in this samples， can know that： the sterile line and maintainer line had one same InDel site in orf106b.The same SNP site were located in orf138a， orf121b ， orf129b and orf110b. These mutations had not make differences on coding sequence of sterile line and maintainer line， these mutations may had nothing to do with the CMS. The sterile lines MSK326 and MSK394 have the same InDel site in orf112a and orf103c. And they had the same SNP site in 65 genes or open reading frame. But the maintainer line had no mutations in these genes or open reading frame. These InDel and SNP had led to the changes of coding sequence in genes or the open reading frame. These mutant sites likely related to their CMS.Some of these mutant sites， including atp1， atp4， atp6， coxl， cox3， atp9， orf25， nad6， nad7， orf108， orf239， orf129 and sdh4 have been reported. This report have confirmed that these mutant sites likely related to their CMS. We had detected the large number of InDel and SNP sites in our research， this found not only helps to further study， also would offer powerful tools for tobacco germplasm identification and marker-assisted selectionin tobacco breeding.

Key words：tobacco； mitochondrial DNA； re-sequencing

重測(cè)序是指對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。在全基因組水平上掃描并檢測(cè)與重要性狀相關(guān)的基因序列差異和結(jié)構(gòu)變異，實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因預(yù)測(cè)。由于其具有檢測(cè)全面、真實(shí)可靠、快速容易等優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者將基因組重測(cè)序廣泛運(yùn)用在水稻、擬南芥、黃瓜、油菜等物種中，成功定位了黃瓜早花基因、水稻抗稻瘟病、不育性等基因。但是在煙草不育機(jī)理的研究中，仍然以通過(guò)SSR和RAPD標(biāo)記以及基因克隆等分子技術(shù)為主，重測(cè)序技術(shù)在煙草不育機(jī)理研究中應(yīng)用較少。

煙草雄性不育的形成十分復(fù)雜，目前廣泛認(rèn)為是控制雄性不育性的遺傳物質(zhì)發(fā)生了變異，導(dǎo)致煙株體內(nèi)生理生化過(guò)程的改變，促使煙株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，從而形成雄性不育[1]。大量研究表明煙草雄性不育是細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核共同調(diào)節(jié)的結(jié)果，但主要是線粒體DNA上發(fā)生的一些變異或者缺失，導(dǎo)致線粒體功能遭到破壞而發(fā)生紊亂，花粉不能正常發(fā)育，造成花絲縮短、花粉囊枯皺等現(xiàn)象[2-3]，從而引起煙草雄性不育，即細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）[4]。Nair認(rèn)為胞質(zhì)雄性不育性的遺傳因子位于線粒體基因組[5]。Bergman等[6]發(fā)現(xiàn)不育系線粒體基因atp1同orf274共轉(zhuǎn)錄本升高導(dǎo)致其ATP/ADP比率顯著降低是該不育類型不育的一個(gè)特點(diǎn)。趙婷等[7]和朱騰義等[8]分別獲得了不育系存在顯著相關(guān)性的atp6和coxII 基因 SNP 位點(diǎn)。劉齊元等[9]發(fā)現(xiàn)不育系和保持系線粒體基因組有明顯的差異，但是對(duì)胞質(zhì)不育類型的煙草雄性不育分子機(jī)理尚未展開(kāi)研究。

通過(guò)線粒體DNA重測(cè)序技術(shù)，對(duì)比分析不育系與保持系的線粒體DNA序列差異，得到與煙草雄性不育相關(guān)的SNP位點(diǎn)，以及系統(tǒng)的挖掘與煙草雄性不育形成相關(guān)的基因，為揭示煙草細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)積極選育煙草雄性不育系，開(kāi)辟煙草雜種優(yōu)勢(shì)利用的新前景有其重要的實(shí)際意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中南煙草實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。以保持系K326、不育系MSK326、保持系K394和不育系MSK394等烤煙品種為材料，兩對(duì)材料是嚴(yán)格的同核異質(zhì)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料于2015年12月26日播種，采用漂浮育苗。成苗后，對(duì)材料進(jìn)行遮光處理培養(yǎng)。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的黃化苗制備線粒體DNA。將制備好的符合要求的DNA樣品送測(cè)序公司重測(cè)序檢測(cè)。

1.3 mtDNA的制備

參考李文強(qiáng)等[10]和李鳳霞等[11]方法，改進(jìn)GENMED公司高多糖/酚植物線粒體DNA萃取試劑盒提取方法制備本試驗(yàn)材料線粒體DNA。

1.4 mtDNA的質(zhì)量及純度檢測(cè)

取7.5 L mtDNA樣品與1.5 μL 6×loading buffer用穩(wěn)壓電泳儀在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Innotech公司）拍照保存。取1 μL mtDNA溶液，加超純水稀釋至100 μL，用Eppendorf BioOhotometer分光光度計(jì)測(cè)出A260/A280、A260/A230 及mtDNA濃度。將檢測(cè)符合的線粒體DNA送諾禾致源生物技術(shù)公司重測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

分析得到的重測(cè)序結(jié)果，采用Excel2003和SPSS軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草線粒體DNA的制備和檢測(cè)

2.1.1 煙草線粒體DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 通過(guò)差速離心的方法，獲得煙草線粒體，然后使用線粒體DNA萃取試劑盒提取的線粒體DNA樣品，對(duì)樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)。由圖1可知樣品均條帶整齊、清楚，無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明mtDNA純度較高，沒(méi)有發(fā)生降解，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.1.2 紫外分光光度法檢測(cè)煙草線粒體DNA純度 純凈的DNA的OD260/230應(yīng)該大于2。當(dāng)OD260/230小于2，表明溶液中有殘留的鹽類雜質(zhì)及其他小分子物質(zhì)。純凈的DNA的OD260/280為1.8。當(dāng)OD260/280>1.9，表明溶液中有RNA污染；當(dāng)OD260/280<1.6，表明溶液中有蛋白質(zhì)、酚類等污染。

從表1可以看出，所有的樣品OD260/230在1.97～2.10之間，OD260/280在1.85～1.92之間，表明提取的DNA純度較高，幾乎沒(méi)有RNA污染，無(wú)蛋白質(zhì)、酚類及其他鹽類物質(zhì)污染，符合重測(cè)序要求。

2.2 不育系與保持系線粒體DNA重測(cè)序比較分析

2.2.1 不育系與保持系線粒體DNA的InDel和SNP統(tǒng)計(jì)與分析 InDel 是指基因組中小片段的插入和缺失序列。SNP（單核苷酸多態(tài)性）主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換等。圖2和圖3分別是各樣品的InDel和SNP統(tǒng)計(jì)結(jié)果。由圖2可知不育系MSK326的InDel個(gè)數(shù)為62個(gè)，高于保持系K326的12個(gè)；其中不育系MSK326中純合InDel個(gè)數(shù)為43，雜合InDel為19個(gè)；且其中插入類型為28個(gè)，缺失類型為34個(gè)。MSK394的InDel為70個(gè)，高于保持系K394的22個(gè)。其中不育系MSK394純合InDel和雜合InDel均為35個(gè)；且其中插入類型為31個(gè)，缺失類型為39個(gè)。圖3可知不育系MSK326和MSK394的SNP個(gè)數(shù)分別為770和766，高于保持系K326和K394的189和199；其中不育系MSK326中純合SNP個(gè)數(shù)為390，雜合SNP為380個(gè)；其中轉(zhuǎn)換類型為307個(gè)，顛換類型為463個(gè)，ts/tv為0.66，低于保持系K326的1.39。不育系MSK394純合SNP個(gè)數(shù)為341，雜合SNP為425個(gè)；且其中轉(zhuǎn)換類型為322個(gè)，顛換類型為444個(gè)，ts/tv為0.73，低于保持系K394的1.21（表2）。

2.2.2 不育系與保持系線粒體DNA的INDel分析 由表3可知保持系K326在編碼區(qū)的InDel只有一個(gè)，K394有兩個(gè)InDel存在；不育系MSK326的InDel有4個(gè)，MSK326有8個(gè)。三個(gè)樣品都在orf106b的177801位點(diǎn)存在缺失，且都是缺少了G堿基。不育系MSK326和MSK394存在兩個(gè)完全一致的InDel；orf112a的19845位點(diǎn)都存在缺失，且都是缺失堿基AAAAAGA；orf103c的227978位點(diǎn)都存在缺失，且都是缺失堿基CCTTAGAGTCAAGTGGCTTTCAGCTCCTCT。這兩個(gè)相同的InDel在保持系上不存在。不育系與保持系在這兩個(gè)基因上的序列不一致，有可能導(dǎo)致了編碼區(qū)的密碼子的變化，從而導(dǎo)致了氨基酸改變，推測(cè)可能與煙草CMS存在聯(lián)系。而orf106b 的177801位置上的缺失在K326，K494和MSK394中均有出現(xiàn)，但在MSK326中沒(méi)有，推測(cè)可能與CMS無(wú)必然聯(lián)系。

2.2.3 不育系與保持系線粒體DNA的SNP位點(diǎn)分析 由表4可知，orf138a、orf121b、orf129b上只在MSK394和K394存在一個(gè)相同位點(diǎn)的突變，K326和MSK326未出現(xiàn)；orf110b上MSk326和K326都存在一個(gè)相同位點(diǎn)的突變，K394和MSK394沒(méi)有?？赏茰y(cè)這些只存在于各自不育系與相應(yīng)保持系的突變位點(diǎn)可能與各自的某些不同性狀有關(guān)，與煙草雄性不育機(jī)理無(wú)關(guān)。只有K394在orf297a、orf121c上存在突變位點(diǎn)，而orf105a上只有K326存在突變位點(diǎn)。orf101d、orf131c、trns、nad1、nad2等基因雖然不育系上都存在突變位點(diǎn)，但是不育系材料的堿基序列與保持系材料一致；且在不育系材料中nad1和nad2雖然堿基發(fā)生了突變，但并未造成編碼的氨基酸改變，推測(cè)這些基因與CMS之間可能無(wú)必然聯(lián)系。不育系在nad7、orf125a、mat-R、orf171a、ccmC、orf112a、atp6、orf177、orf110a、orf112a、orf112b、rpl5、atp1、orf161、orf151、rrn18、orf108、orf25、orf102b、ccmFN、cox1、rps10、orf315、orf129、rps13、atp9、orf237、orf239、orf134、orf214、nad6、sdh4、cox1、atp4、atp8、orf239、orf134、orf214、orf103b、orf119b、orf306、orf114a、orf147、orf166a、orf118、orf144、orf107、orf190、orf111c、cox3、orf125e、orf274、trnM、orf131b、orf202、nad6、rps4、ccmB、orf125g和orf141上均發(fā)生了突變，其中不育系MSK3426和MSK394在ccmC上有相同突變位點(diǎn)有10個(gè)，atp6上有5個(gè)，orf239上有11個(gè)，orf147有4個(gè)，orf274有7個(gè)，且這些突變沒(méi)有發(fā)生在保持系上或者與保持系突變位點(diǎn)不同。這些突變導(dǎo)致了不育系與保持系編碼區(qū)序列的差異，也改變了不育系上相關(guān)基因的編碼序列，造成了密碼子的改變，從而導(dǎo)致了氨基酸改變，影響了有關(guān)蛋白質(zhì)的合成。推測(cè)這些差異突變可能與煙草CMS存在聯(lián)系。

2.2.4 SNP位點(diǎn)基因注釋以及與煙草不育相關(guān)性分析 atp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf108、orf25、orf239、orf129、sdh4等基因上出現(xiàn)的突變位點(diǎn)與前人研究報(bào)道一致，且目前已有這些基因上的SNP突變被證實(shí)與煙草CMS有關(guān)。其中atp1[12]、atp4[13]、atp6、atp9[14]都有過(guò)相關(guān)研究報(bào)道，這些基因都與ATP合酶的正常功能的發(fā)揮密切相關(guān)（表5）。ATP合酶是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化過(guò)程的關(guān)鍵酶?；ǚ郯l(fā)育是一個(gè)高耗能的過(guò)程，若某個(gè)或某些基因產(chǎn)物干擾了線粒體F0F1-ATP合成酶的功能，將可能導(dǎo)致花粉的敗育。Ashutosh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在帶有Moricandia arvensis胞質(zhì)的芥菜中，線粒體基因上的orf 108與雄性不育有關(guān)；Yamamoto等[16]發(fā)現(xiàn)，orf129特異存在于甜菜CMS中。He S等[17]將嵌合基因ORF239轉(zhuǎn)入煙草核基因組，煙草花粉敗育，表明orf239與煙草雄性不育有關(guān)。張長(zhǎng)靜等[18]研究表明不育系的sdh4基因第28位堿基發(fā)生了改變；以致其編碼蛋白改變，這極可能成為干擾線粒體琥珀酸脫氫酶亞基3功能的關(guān)鍵因素，從而成為可能導(dǎo)致煙草CMS的根本原因之一。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

不育系MSK326和MSK394線粒體DNA序列上出現(xiàn)的InDel和SNP遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于保持系K326和K394。這些基因組中小片段的插入和缺失核苷酸的變異影響了DNA序列上堿基的變化，改變了原來(lái)的密碼子，導(dǎo)致氨基酸變化，很可能與物種的某些性狀的出現(xiàn)有關(guān)。與保持系線粒體DNA相比，不育系線粒體DNA在orf112a和orf103c的相同位點(diǎn)上均出現(xiàn)了相同的堿基缺失，導(dǎo)致了不育系與保持系orf112a和orf103c上編碼序列的差異。目前還沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)orf112a和orf103c與CMS相關(guān)的研究報(bào)道，但并不能否認(rèn)orf112a和orf103c上的缺失就與煙草雄性不育的形成無(wú)關(guān)。

不育系在orf138a、orf121b、orf129b、orf110b、orf297a、orf121c、orf105a、orf101d、orf131c、trns、nad1、nad2等基因上都存在突變位點(diǎn)，但在保持系上同樣出現(xiàn)了相同的突變，導(dǎo)致不育系材料的堿基序列與保持系材料一致。且不育系材料中nad1和nad2雖然堿基發(fā)生了突變，但并未造成編碼的氨基酸改變，推測(cè)這些基因上的突變與CMS之間可能無(wú)必然聯(lián)系。不育系在線粒體DNA上的nad7、orf125a、mat-R、orf171a、ccmC、orf112a、atp6、orf177、orf110a、orf112a、orf112b、rpl5、atp1、orf161、orf151、rrn18、orf108、orf102b、ccmFN、cox1、rps10、orf315、orf129、rps13、atp9、orf237、orf239、orf134、orf214、nad6、sdh4、cox1、atp4、atp8、orf239、orf134、cox3、trnM、nad6、ccmB等均發(fā)生了突變，導(dǎo)致了不育系與保持系在編碼區(qū)序列的差異，并且堿基的改變?cè)斐闪税被岬耐蛔?，推測(cè)可能與煙草CMS存在密切的聯(lián)系。其中ccmC，atp6，orf239，orf147，orf274等上突變位點(diǎn)較多。

目前，已有atp1、atp4、atp6、coxl、orf25、cox3、atp9、orf108、orf239、orf129、sdh4基因上的SNP可能與CMS相關(guān)已經(jīng)被證實(shí)。其他基因上的SNP突變是否與CMS相關(guān)少有報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 討 論

煙草線粒體DNA的提取關(guān)鍵在于獲得高純度且完整的線粒體DNA。由于煙草既有細(xì)胞壁、液泡和葉綠體DNA等多種物質(zhì)的干擾，又含高糖高酚；分離提取線粒體DNA的難度較大。經(jīng)過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)線粒體試劑盒方法，改進(jìn)普通線粒體提取方法，得到的mtDNA電泳條帶清晰、無(wú)污染。使用幼嫩的黃化草葉片，容易使煙草組織破碎，提高了mtDNA的產(chǎn)率，也一定程度避免了葉綠體DNA的影響。

通過(guò)高通量重測(cè)序技術(shù)，挖掘的大量的InDel和SNP位點(diǎn)，其中不少SNP同時(shí)發(fā)生在不育系與保持系上，且突變位置相同。雖然這些SNP與煙草的不育機(jī)理無(wú)關(guān)，但是這些SNP是否與樣品的某些其它性狀有關(guān)。這些SNP的挖掘有助于進(jìn)一步對(duì)K326和K394品種進(jìn)行研究。結(jié)合前人的研究報(bào)道以及分子信息學(xué)的研究，那些導(dǎo)致不育系和保持系序列差異的SNP突變有一部分被證實(shí)與煙草CMS形成密切相關(guān)，如tp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf108、orf239、orf25、orf129、sdh4等。為揭示煙草細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子機(jī)理提供了直接的分子依據(jù)，也為進(jìn)一步為創(chuàng)造新的不育性品種提供了可能。但還有大量的SNP位點(diǎn)與煙草雄性不育的相關(guān)性有待于進(jìn)一步驗(yàn)證，有助于進(jìn)一步探究煙草雄性不育的形成機(jī)理。

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