韓海燕，陳家秀，張立欣，傅 強(qiáng)

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院干部病房，福建 福州 350009

丙氨酰-谷氨酰胺治療重癥急性胰腺炎機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

韓海燕，陳家秀，張立欣，傅 強(qiáng)

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院干部病房，福建 福州 350009

目的 研究腸內(nèi)及腸外營養(yǎng)途徑給予丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)對重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)大鼠腸道炎癥反應(yīng)及免疫功能變化的影響，探討其作用機(jī)制。方法 以假手術(shù)組(20只)大鼠作為對照，將60只SAP組的大鼠隨機(jī)分為4組：EN組、EN+Gln組、PN組、PN+Gln組。分別收集上述5組大鼠手術(shù)后1 h、5 h、10 h、24 h、48 h、72 h時間點(diǎn)的血清，采用ELISA法檢測各時間點(diǎn)血清中淀粉酶(AMS)、熱休克蛋白-70(HSP-70)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。72 h后處死大鼠，分別取上述5組大鼠回盲部腸管，ELISA法檢測回腸內(nèi)容物分泌型IgA(S-IgA)的含量，流式細(xì)胞法檢測腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平。 結(jié)果 與對照組相比，SAP組大鼠血清AMS及HSP-70、TNF-α水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與EN組相比，EN+Gln組大鼠HSP-70、TNF-α水平更早下降，且下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PN組相比，PN+Gln組大鼠HSP-70、TNF-α水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，SAP組大鼠腸內(nèi)容物S-IgA含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，SAP組大鼠腸上皮細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與EN組相比，EN+Gln組大鼠腸內(nèi)容物S-IgA含量明顯升高，腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PN組相比，PN+Gln組大鼠S-IgA含量、腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 SAP大鼠血清淀粉酶及HSP-70、TNF-α水平明顯升高，HSP-70及TNF-α可能參與SAP的炎癥反應(yīng)；早期腸內(nèi)營養(yǎng)添加Ala-Gln可以降低SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平，可以提高腸道局部CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞水平，增強(qiáng)腸道局部免疫反應(yīng)，具有治療SAP的作用。

重癥急性胰腺炎；谷氨酰胺；腸道炎癥反應(yīng)；腸道免疫反應(yīng)

谷氨酰胺(Gln)是一種由骨骼肌產(chǎn)生的氨基酸，參與體內(nèi)多種代謝活動。當(dāng)全身性炎癥反應(yīng)、大手術(shù)應(yīng)激等時，骨骼肌產(chǎn)生的Gln無法滿足機(jī)體對其的消耗，造成Gln缺乏，繼而引起全身性感染甚至死亡，因此Gln目前被列為條件必需氨基酸之一[1-3]。由于Gln不穩(wěn)定，常與丙氨酸結(jié)合制成穩(wěn)定的Gln雙肽，臨床上有報道應(yīng)用丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)治療SAP，但具體機(jī)制尚未完全明了，本文擬通過動物實(shí)驗(yàn)研究Ala-Gln對SAP大鼠的熱休克蛋白-70(HSP-70)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及腸道免疫功能的影響，探討其可能的作用機(jī)制，并探討其最佳的使用途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 采用福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的清潔級SD大鼠，體質(zhì)量180～240 g，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為SAP組(60只)和對照組(20只)。SAP組又隨機(jī)分為EN組、EN+Gln組、PN組、PN+Gln 組。

1.3 動物模型的制備 通過逆行胰膽管注射?；悄懰徕c溶液建立大鼠SAP模型，采用傳統(tǒng)的Aho[4]逆行胰膽管注射法建立大鼠SAP模型。SAP大鼠術(shù)中將3.5%?；悄懰徕c溶液用微量注射泵恒速注入胰膽管內(nèi)，用量1 ml/kg，以0.2 ml/min的速度注射完畢；對照組大鼠術(shù)中使用生理鹽水進(jìn)行胰膽管灌注，劑量及方法同SAP組。EN組采取胃十二指腸置管方法進(jìn)行腸內(nèi)營養(yǎng)，PN組采取尾靜脈留置插管方法進(jìn)行腸外營養(yǎng)。對照組進(jìn)行假手術(shù)后給予自由普通飲食。

1.4 營養(yǎng)制劑 EN營養(yǎng)制劑組分為：水、麥芽糊精、酪蛋白、植物油、膳食纖維(大豆多糖等)、礦物質(zhì)、維生素和微量元素等。每100 ml提供總能量100 kal，碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪供能比為61∶20∶19。PN營養(yǎng)制劑：采用50%葡萄糖、20%復(fù)方氨基酸和20%脂肪乳劑作為基本營養(yǎng)成分，每100 ml提供總能量100 kal，碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪供能比為56∶19∶25。Gln制劑：EN+Gln組及PN+Gln組動物每天腸內(nèi)及腸外營養(yǎng)液中添加0.4 g/kg純度為98%的Ala-Gln雙肽(力肽注射劑，華瑞公司產(chǎn)品)。所有實(shí)驗(yàn)動物可自由飲水。營養(yǎng)制劑的劑量為每天250 ml/kg，麻醉蘇醒后2 h開始輸注營養(yǎng)液，第1天輸半量，第2天開始輸全量。各組營養(yǎng)液當(dāng)天配制，用微量注射器泵在24 h內(nèi)均勻輸注。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 血清AMS、HSP-70及TNF-α含量的測定：分別收集上述5組大鼠手術(shù)后1 h、5 h、10 h、24 h、48 h、72 h時間點(diǎn)的血清，按說明書采用ELISA法檢測各時間點(diǎn)血清中淀粉酶(AMS)、HSP-70、TNF-α的水平。ELISA試劑盒購自上海藍(lán)基科技有限公司。

1.5.2 腸內(nèi)容物S-IgA含量：取盲腸內(nèi)容物，加入4 ml生理鹽水，4 ℃冰箱震蕩過夜，4 000 r/min離心10 min，取上清液按ELISA試劑盒(購自上海藍(lán)基生物科技有限公司)操作方法檢測。

1.5.3 腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞檢測：在大鼠小腸的近端空腸5 cm以下處取2 cm 長的空腸(回盲部腸管)，勻漿后，4 ℃條件下，準(zhǔn)確稱量0.3 g腸組織，剪碎，移入玻璃勻漿器，然后加入預(yù)冷的生理鹽水至總體積3 ml，在冰浴中用玻璃勻漿器仔細(xì)研磨，制備10%腸組織勻漿。將勻漿液低溫離心(4 ℃，3 500 r/min)10 min，取上清液，使用流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司的COULTER?DNA PREPTMReagents Kit)測定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的百分比及CD68+巨噬細(xì)胞的百分比。

2 結(jié)果

2.1 SAP組和對照組大鼠不同時間點(diǎn)血清中AMS、HSP-70及TNF-α的水平 SAP組大鼠血清AMS水平在術(shù)后1 h開始升高，術(shù)后10 h達(dá)峰值，術(shù)后24 h開始下降，對照組大鼠血清淀粉酶水平無明顯變化(見圖1)。SAP組及對照組大鼠血清HSP-70及TNF-α水平均于術(shù)后1 h開始升高，術(shù)后5 h達(dá)峰值，與對照組相比，SAP大鼠升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。SAP組大鼠血清HSP-70及TNF-α水平持續(xù)時間更久，術(shù)后24 h開始下降，對照組術(shù)后10 h開始下降(見圖2、圖3)。

2.2 EN組內(nèi)SAP大鼠不同時間點(diǎn)血清HSP-70及TNF-α的水平 EN組SAP大鼠術(shù)后10 h血清HSP-70、TNF-α水平開始下降，EN+Gln組SAP大鼠HSP-70、TNF-α水平也術(shù)后10 h開始下降，EN+Gln組下降更明顯，兩組大鼠下降的幅度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4、圖5)。

2.3 PN組內(nèi)SAP大鼠不同時間點(diǎn)血清HSP-70及TNF-α的水平 兩組SAP大鼠血清HSP-70、TNF-α水平均于術(shù)后10 h開始下降，與PN組SAP大鼠相比，PN+Gln組SAP大鼠下降的幅度更明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖6、圖7)。

2.4 SAP組和對照組大鼠腸內(nèi)容物S-IgA的含量及腸上皮淋巴細(xì)胞分布 與對照組相比，SAP組大鼠腸內(nèi)容物S-IgA的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，SAP組大鼠腸上皮細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

注：各組橫坐標(biāo)中1～6代表術(shù)后1 h、術(shù)后5 h、術(shù)后10 h、術(shù)后24 h、術(shù)后48 h、術(shù)后72 h。

圖1 兩組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)的AMS濃度; 圖2 兩組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)的HSP-70濃度； 圖3 兩組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)的TNF-α濃度; 圖4 EN及EN+Gln組大鼠術(shù)后各時間點(diǎn)的HSP-70濃度；圖5 EN及EN+Gln組大鼠術(shù)后各時間點(diǎn)的TNF-α濃度;圖6 PN及PN+Gln組大鼠術(shù)后各時間點(diǎn)的HSP-70濃度；圖7 PN及PN+Gln組大鼠術(shù)后各時間點(diǎn)的TNF-α濃度

Fig 1 The differences of AMS between two groups of rats at different time points after surgery; Fig 2 The differences of HSP-70 between two groups of rats at different time points after surgery; Fig 3 The differences of TNF-α between two groups of rats at different time points after surgery; Fig 4 The differences of HSP-70 between EN group and EN+Gln group of rats at different time points after surgery; Fig 5 The differences of TNF-α between EN group and EN+Gln group of rats at different time points after surgery; Fig 6 The differences of HSP-70 between PN group and PN+Gln group of rats at different time points after surgery; Fig 7 The differences of TNF-α between PN group and PN+Gln group of rats at different time points after surgery

S?IgA含量(mg/ml)CD3+T淋巴細(xì)胞(%)CD4+T淋巴細(xì)胞(%)CD8+T淋巴細(xì)胞(%)CD68+巨噬細(xì)胞(%)SAP組0．663±0．16730．124±5．24237．492±6．78116．498±5．64826．359±6．875對照組1．915±0．34839．258±7．85448．472±8．56424．125±5．24635．746±7．215F值969．562123．39172．8174．473144．48P值<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

2.5 EN組及PN組SAP大鼠腸內(nèi)容物S-IgA的含量及腸上皮淋巴細(xì)胞分布 與EN組相比，EN+Gln組大鼠腸內(nèi)容物S-IgA含量明顯升高，腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.305、111.37、23.158、89.848、86.895，P均<0.001)；與PN組相比，PN+Gln組大鼠S-IgA含量、腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.039、3.052、2.346、2.461、0.625，P值依次為0.846、0.098、0.143、0.134、0.44，見表2)。

S?IgA含量(mg/ml)CD3+T淋巴細(xì)胞(%)CD4+T淋巴細(xì)胞(%)CD8+T淋巴細(xì)胞(%)CD68+巨噬細(xì)胞(%)EN組0．695±0．26530．154±5．39739．193±7．23516．269±5．26725．398±5．147EN+Gln組2．034±0．684?42．531±6．186?49．127±9．487?26．481±4．288?33．157±6．589?PN組0．852±0．84131．184±7．97337．149±9．14618．532±6．21729．345±7．658PN+Gln組0．966±0．71233．129±10．59742．421±7．98422．174±5．18932．985±7．614

注：與EN組比較，*P<0.001。

3 討論

SAP是臨床上常見的危重疾病，死亡率高，但其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為急性胰腺炎是由胰酶“自身消化”所致，但缺乏臨床證據(jù)。目前認(rèn)為，炎癥介質(zhì)在急性胰腺炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用。HSP-70是分子量約70 kD的熱休克蛋白，是熱休克蛋白家族中重要的一員，被稱為主要熱休克蛋白，包括分子量為68、72、73、75、78 kD等20多種蛋白。在正常生理?xiàng)l件下，如細(xì)胞的增生和分化、胚胎的生長和發(fā)育、激素的刺激等，熱休克蛋白即呈基礎(chǔ)表達(dá)。正常生長條件下，所有細(xì)胞中，熱休克蛋白占總蛋白量的5%～10%。在應(yīng)激條件下熱休克蛋白表達(dá)明顯增加，且可發(fā)生移位。TNF-α是敗血癥和多器官衰竭的早期炎癥介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAP組大鼠血清HSP-70及TNF-α水平更早升高，且持續(xù)時間更久，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示促炎細(xì)胞因子HSP-70及TNF-α在SAP發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

Gln是人體最多的游離氨基酸之一，在生理情況下是非必需氨基酸。在某些危重疾病，如急性胰腺炎時,Gln明顯缺乏，具體的機(jī)制目前尚未完全明了。原因可能為Gln是小腸的主要能量來源，是維持腸道免疫功能的重要氨基酸,也是核酸生物合成所必需的原料，而在分解代謝狀態(tài)下和嚴(yán)重應(yīng)激時，利用Gln的組織及細(xì)胞,如腸黏膜和受刺激的免疫細(xì)胞對Gln需要迅速增加,超過體內(nèi)合成造成Gln相對缺乏。在SAP時,腸道Gln消耗明顯增加，Gln利用率也明顯下降，可能會降低細(xì)胞增殖率,進(jìn)而影響腸道細(xì)胞分化和黏膜細(xì)胞更新。在SAP病程進(jìn)展中，Gln缺乏將導(dǎo)致腸道細(xì)菌易位，免疫功能紊亂。近20年動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)都表明Gln有促進(jìn)氮平衡,保持腸黏膜完整，防止細(xì)菌易位和腸毒素入血,增加腸免疫和全身免疫等諸多特殊功效，但其對炎癥因子的影響研究較少。本實(shí)驗(yàn)中，腸內(nèi)營養(yǎng)或腸外營養(yǎng)中添加Ala-Gln的SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平均明顯降低，提示Gln可能通過抑制促炎癥因子的水平發(fā)揮抗SAP作用。而與單純腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，添加Ala-Gln的SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平下降差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腸外營養(yǎng)添加Ala-Gln的SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平下降差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示添加Gln的保護(hù)型EN具有明顯的抗炎性作用，療效優(yōu)于腸外營養(yǎng)。

如何保護(hù)腸道功能屏障是治療SAP的首要任務(wù)，而腸道免疫功能屏障是腸道功能屏障的重要組成部分，其在保護(hù)SAP腸道功能屏障中的作用日益突出。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5-6]表明，SAP時Gln明顯缺乏，補(bǔ)充Gln具有治療SAP的作用，而目前Gln對SAP是否具有保護(hù)腸道免疫功能屏障的作用研究較少。

腸道免疫屏障由腸上皮細(xì)胞(intestinalepithelial cell, iEC)、腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intestinal intraepithelial lymphocyte, iIEL)、 固有層淋巴細(xì)胞(lamina proprial lymphocyte, LPL)、派伊氏結(jié)(peyer patch, PP)和腸系膜淋巴結(jié)等腸道組織及腸道漿細(xì)胞S-IgA構(gòu)成[7]，其主要功能是由相關(guān)淋巴樣組織通過S-IgA發(fā)揮抗感染的體液免疫及細(xì)胞毒性的細(xì)胞免疫。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比，SAP組大鼠腸內(nèi)容物細(xì)菌S-IgA的含量、腸上皮細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平明顯降低，說明SAP時腸道免疫功能屏障明顯受損。由于Gln不穩(wěn)定，常與丙氨酸結(jié)合制成穩(wěn)定的Gln雙肽。本實(shí)驗(yàn)中，分別應(yīng)用腸內(nèi)營養(yǎng)及腸外營養(yǎng)兩種不同途徑添加Gln。結(jié)果顯示，與EN組相比，EN+Gln組大鼠腸內(nèi)容物S-IgA含量明顯升高，腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與PN組相比，PN+Gln組大鼠腸內(nèi)容物S-IgA含量、腸上皮內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明腸內(nèi)營養(yǎng)添加Gln具有明顯提高腸道局部體液免疫及細(xì)胞免疫，保護(hù)腸道免疫功能屏障，從而達(dá)到治療SAP的作用。

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(責(zé)任編輯：李 健)

The protective effect and mechanism of alanyl-glutamine dipeptide in treatment of severe acute pancreatitis

HAN Haiyan, CHEN Jiaxiu, ZHANG Lixin, FU Qiang

Cadre Ward, Fuzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350009, China

Objective To investigate the protective effect and mechanism of alanyl-glutamine dipeptide(Ala-Gln) in treatment of severe acute pancreatitis (SAP) in rats．Methods Eighty rats were divided into control group (20 rats) and SAP groups (60 rats) which were randomly divided into 4 groups (enteral nutrition with/without Ala-Gln & parenteral nutrition with/without Ala-Gln groups)．The levels of amylase (AMS), heat shock protein-70 (HSP-70) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum at different time points and the levels of secrete-IgA (S-IgA) and CD3+, CD4+, CD8+CD68+T cells in ileocecus intestine were measured in different groups.Results Compared with control group, the levels of AMS, HSP-70 and TNF-α were significantly increased in SAP groups (P<0.05)．The levels of HSP-70 and TNF-α were significantly declined in EN+Gln group compared with EN group (P<0.05). Meanwhile, the level of secrete-IgA (S-IgA) was significantly declined and the levels of CD3+, CD4+, CD8+CD68+T cells in ileocecus intestine were significantly increased in EN+Gln group compared with EN group (P<0.001).Conclusion Ala-Gln may protect SAP rats by increasing intestinal immune response and declining its inflammatory reaction. Enteral nutrition with Ala-Gln may be the best way to treat SAP.

Severe acute pancreatitis; Glutamine; Intestinal inflammatory reaction; Intestinal immune response

2014年福建省科技項(xiàng)目計(jì)劃(2014D030)；2013年福州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013-S-122-2)

韓海燕，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：胰腺疾病。E-mail：hhy1752@hotmail.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.015

論著·胰腺疾病

R576

A

1006-5709(2016)08-0892-04

2015-09-28