張 俊，盧桂芳，任牡丹，盧新蘭，曹瑞琪，閆紅林，王 新，和水祥

1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710061； 2. 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

鹽酸青藤堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡及其死亡受體DR4、DR5表達(dá)的變化

張 俊1，盧桂芳1，任牡丹1，盧新蘭1，曹瑞琪2，閆紅林2，王 新1，和水祥1

1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710061； 2. 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 觀察人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡過(guò)程中死亡受體DR4、DR5的表達(dá)，探討鹽酸青藤堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，經(jīng)不同濃度鹽酸青藤堿作用后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；Hoechst染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡；用Western blotting方法檢測(cè)人肝癌細(xì)胞DR4、DR5的表達(dá)。結(jié)果 鹽酸青藤堿對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并呈劑量、時(shí)間依賴性，不同濃度組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Hoechst33258染色可見(jiàn)凋亡細(xì)胞皺縮，核碎裂，也可見(jiàn)典型凋亡小體；在蛋白水平，鹽酸青藤堿處理后SMMC-7721細(xì)胞死亡受體DR4、DR5的表達(dá)水平較未處理組顯著增加(P<0.05)。結(jié)論 鹽酸青藤堿可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，此作用可能與細(xì)胞內(nèi)死亡受體DR4和DR5表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

肝細(xì)胞癌；SMMC-7721；死亡受體DR4/DR5；鹽酸青藤堿；凋亡

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是導(dǎo)致人類死亡的第二大全身性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升，但傳統(tǒng)治療方法對(duì)HCC的治療效果均不理想，患者5年生存率低于26%。因此，進(jìn)一步研究HCC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療途徑和方法對(duì)HCC的治療至關(guān)重要。青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的單體生物堿，具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、降血壓、促組胺釋放、抗心律失常等藥理作用。目前研究[1]發(fā)現(xiàn)，其在幾種腫瘤細(xì)胞中，包括白血病、滑膜肉瘤、前列腺癌、肺癌、宮頸癌和HCC，均顯示出體外抗腫瘤的藥理活性。本研究中，我們觀察了鹽酸青藤堿在誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中死亡受體DR4、DR5表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討其在誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分子實(shí)驗(yàn)中心陳威主任惠贈(zèng)。鹽酸青藤堿購(gòu)自中國(guó)湖南正清藥業(yè)公司，溶解于DMEM新鮮培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清，終質(zhì)量濃度為100 mmol/L)4 ℃冷藏備用。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自中國(guó)浙江杭州四季青公司；胰蛋白酶及SMSO均購(gòu)自Sigma公司；兔抗人DR4多抗購(gòu)自Proteintech公司，兔抗人DR5多抗，鼠抗人β-actin單抗、山羊抗兔DR4、DR5二抗、山羊抗鼠β-actin二抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng)：人肝癌SMMC-7721細(xì)胞在含10%胎牛血清、50 U/L青霉素和50 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫，5% CO2密閉傳代培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理及分組：鹽酸青藤堿以含10%胎牛血清的DMEM溶解，使用時(shí)以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，在前期工作基礎(chǔ)上，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)5個(gè)試驗(yàn)組，各組濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L，另設(shè)0 mmol/L為陰性對(duì)照組，根據(jù)MTT結(jié)果選取合適梯度濃度的鹽酸青藤堿處理肝癌細(xì)胞。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)SMMC-7721的增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM制備細(xì)胞懸液3×104個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔200 μl，生長(zhǎng)24 h后，隨機(jī)分6組，每組5個(gè)復(fù)孔，加入鹽酸青藤堿終濃度分別為0 mmol/L(陰性對(duì)照組)、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L的培養(yǎng)液，分別作用24 h、48 h、72 h后，每孔加新配置的5 mg/ml的MTT貯存液20 μl，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清，每孔加150 μl DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，酶標(biāo)490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。抑制率(%)=(對(duì)照孔A490-實(shí)驗(yàn)孔A490)/對(duì)照孔A490×100%。

1.2.4 Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡：以0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種在預(yù)先放置蓋玻片的6孔板上，隨機(jī)設(shè)陰性對(duì)照組(0 mmol/L)和鹽酸青藤堿組(2.0 mmol/L)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，48 h后收集各作用組的肝癌細(xì)胞，每孔加入500 μl多聚甲醛固定液固定15 min后，用PBS清洗，每孔加入500 μl熒光染液Hochest33258室溫?fù)u床上孵育5 min，PBS清洗，完全干燥后用甘油封片，倒置載玻片于熒光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果評(píng)判：在正常對(duì)照的細(xì)胞中，細(xì)胞核的形態(tài)飽滿且規(guī)則，顏色為較深的藍(lán)色，而凋亡陽(yáng)性細(xì)胞是指細(xì)胞核出現(xiàn)了碎塊狀的致密濃染，且顏色發(fā)白。

1.2.5 Western blotting法檢測(cè)DR4、DR5蛋白的表達(dá)：給藥48 h后，3 ml PBS洗2遍，加入500 μl蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白提取液，冰上裂解5 min，用細(xì)胞刮刮下培養(yǎng)皿中細(xì)胞斜放于冰上裂解20 min，刮取細(xì)胞后加到1.5 ml離心管中，4 ℃、12 000×g離心20 min，收集上清液。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取40 μg蛋白用12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳220 V，1 h。電泳完畢后，剝離下完整膠，用半干轉(zhuǎn)膜儀250 mA電轉(zhuǎn)40 min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。根據(jù)目的蛋白分子量的大小裁剪適當(dāng)大小的條帶膜，將膜用封閉液封閉1 h，取出膜，加入適當(dāng)體積的一抗稀釋液(用PBST溶液以適當(dāng)比例稀釋，其中anti-DR4單抗1∶1 000，anti-DR5單抗1∶3 000，anti-β-actin單抗1∶1 000)雜交過(guò)夜，后用TBST洗膜3次，每次10 min，然后加入適當(dāng)體積的、合適種屬的二抗稀釋液，1 h后取出膜，PBST洗3次，每次5 min。加入顯色劑閉光顯色，顯色后凝膠成像系統(tǒng)照相并用密度分析軟件對(duì)蛋白量進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸青藤堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 鹽酸青藤堿對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，與陰性對(duì)照組相比，0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L組的鹽酸青藤堿均可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)，且該抑制作用具有典型的濃度-時(shí)間依賴性，其中以4.0 mmol/L組作用48 h的抑制率最高，可達(dá)87%(見(jiàn)圖1)。

圖1 鹽酸青藤堿對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用

2.2 熒光顯微鏡觀察SMMC-27721細(xì)胞凋亡變化 2.0 mmol/L鹽酸青藤堿處理細(xì)胞48 h后，用Hoechst33258染色可見(jiàn)凋亡細(xì)胞皺縮，核染色質(zhì)濃縮、核碎裂，也可見(jiàn)典型的凋亡小體，而陰性對(duì)照組細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)豐富而飽滿(見(jiàn)圖2)。

圖 2 熒光顯微鏡觀察SMMC-7721細(xì)胞凋亡(200×) A：陰性對(duì)照組；B：2.0 mmol/L鹽酸青藤堿組

Fig 2 The apoptosis of SMMC-7721 cells observed by fluorescence microscopy (200×) A: negative control group; B: 2.0 mmol/L Sinomenine hydrochloride group

2.3 Western blotting檢測(cè)各組SMMC-7721細(xì)胞中DR4、DR5的蛋白表達(dá) DR4、DR5蛋白在陰性對(duì)照組中就有表達(dá)，經(jīng)鹽酸青藤堿作用后，DR4、DR5的蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，表現(xiàn)為鹽酸青藤堿呈劑量依賴性增加DR4、DR5的蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖3)。

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

細(xì)胞凋亡又叫程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)，是細(xì)胞在多種因子調(diào)控下發(fā)生的一種主動(dòng)結(jié)束自身生命的一種死亡方式。Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要通過(guò)3種信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，分別是死亡受體(death receptor，DR)介導(dǎo)(外源性)的凋亡、線粒體(mitochondria)介導(dǎo)(內(nèi)源性)的凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)介導(dǎo)的凋亡。3條通路之間有交叉對(duì)話，共同介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡受體(death receptor，DR)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡又稱外源性凋亡(extrinsic apoptosis)。由細(xì)胞外的相關(guān)配體與死亡受體結(jié)合而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。已知的死亡受體有5類：TNFR-1(CD120a、p55)、FAS(CD95、Apo1)、DR3(Apo3、WSL21、TRAMP、LARD)、DR4和DR5(Apo2、TRAIL-R2、TRICK2、KILLER)，其中前3種受體相應(yīng)的配體分別為TNF、FasL(又稱CD95L)和APO23L，后2種的配體均為APO22L(TRAIL)。死亡配體與死亡受體的結(jié)合可導(dǎo)致受體胞質(zhì)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域聚集并形成能與銜接蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，募集相應(yīng)的銜接蛋白與之結(jié)合，形成配體-受體-銜接蛋白復(fù)合物，即死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(death-inducing signalling complex，DISC)，DISC募集并激活procaspase-8，活化的caspase-8能夠剪切活化下游的caspase而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。多數(shù)情況下，大劑量的化療藥物可以通過(guò)不同途徑有效地殺死腫瘤細(xì)胞，但是治療過(guò)程中往往出現(xiàn)一些毒副反應(yīng)(如骨髓抑制、心臟毒性、惡習(xí)嘔吐等)，因而學(xué)者們一直致力于研發(fā)低毒性、低劑量的有效藥物。

鹽酸青藤堿(Sinomenine hydrochloride)是青藤堿的水溶性鹽酸鹽，臨床用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，療效肯定，無(wú)明顯毒副作用。研究[1]發(fā)現(xiàn)，青藤堿不僅有抗炎等活性，還具有抗腫瘤活性。在肝癌中，國(guó)內(nèi)有研究初步報(bào)道了青藤堿在體外誘導(dǎo)人HCC HepG2細(xì)胞凋亡的作用[2-3]。相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道了死亡受體不僅可在肺癌[4]、星狀細(xì)胞癌[5]、白血病[6]、卵巢癌[7]等中表達(dá)，還在多種人肝癌細(xì)胞中表達(dá)[8]，而且多種藥物如化療藥物可以抑制人肝癌細(xì)胞死亡受體DR4、DR5的表達(dá)水平[9-10]。本課題組前期研究證明了鹽酸青藤堿可抑制人肝癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，可抑制裸鼠皮下人肝癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)；鹽酸青藤堿體外誘導(dǎo)的人HCC細(xì)胞凋亡呈caspase依賴性，線粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路參與其中[11]；據(jù)此推理，死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路是否也參與其中是本課題欲解決的關(guān)鍵問(wèn)題。為此，我們進(jìn)一步研究了鹽酸青藤堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡過(guò)程中死亡受體DR4、DR5表達(dá)的變化，MTT結(jié)果顯示鹽酸青藤堿以時(shí)間和濃度依賴的方式抑制人HCC SMMC-7721細(xì)胞的增殖；Hoechst33258染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察SMMC-7721細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞皺縮，核染色質(zhì)濃縮、核碎裂，隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，死亡細(xì)胞增多，有典型的凋亡小體形成，證實(shí)了青藤堿對(duì)人肝癌細(xì)胞不僅有增殖抑制作用，還有凋亡誘導(dǎo)作用；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，隨著青藤堿劑量的增加，DR4、DR5的蛋白表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)，各組表達(dá)均高于陰性對(duì)照組，其中1.0、2.0 mmol/L鹽酸青藤堿作用組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即鹽酸青藤堿能夠濃度依賴性地上調(diào)死亡受體DR4、DR5蛋白表達(dá)水平，提示，死亡受體DR4、DR5表達(dá)上調(diào)可能是鹽酸青藤堿抗癌作用的機(jī)制之一，這也為開發(fā)應(yīng)用鹽酸青藤堿防治肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，多種信號(hào)通路如MAPK等在鹽酸青藤堿誘導(dǎo)乳腺癌等其他腫瘤中發(fā)揮作用[12]，而MAPK等其他上下游相關(guān)信號(hào)通路在鹽酸青藤堿誘導(dǎo)人HCC凋亡過(guò)程中是否也發(fā)揮作用？此外也有學(xué)者報(bào)道青藤堿可以通過(guò)誘導(dǎo)血管正?；瘉?lái)抑制乳腺癌等腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移等[13]，因此，這為我們探討青藤堿抗腫瘤作用的機(jī)制提供了又一新的思路，值得我們進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Sinomenine hydrochloride inducing apoptosis of hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells and its effect on expressions of DR4 and DR5

ZHANG Jun1, LU Guifang1, REN Mudan1, LU Xinlan1, CAO Ruiqi2, YAN Honglin2, WANG Xin1, HE Shuixiang1

1. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 2. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, China

Objective To investigate the expression levels of DR4 and DR5 on the process of apoptosis induced by Sinomenine hydrochloride in hepatocellular carcinoma (HCC) SMMC-7721 cells.Methods MTT assay was used to determine the effect of Sinomenine hydrochloride on the growth of hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells. In vitro cultured human HCC SMMC-7721 cells: the effect of Sinomenine hydrochloride on the morphologic change induced by sinomenine hydrochloride were assessed by fluorescence microscope after Hoechst staining. SMMC-7721 cells were cultured for 48 hours with Sinomenine hydrochloride 2 mmol/L, then the effect of Sinomenine hydrochloride on death receptors (DR4 and DR5) were detected by Western blotting.Results Sinomenine hydrochloride inhibited the growth of human HCC SMMC-7721 cells in a concentration-and time-dependent manner as determined by MTT assay. In vitro cultured human HCC SMMC-7721 cells, Sinomenine hydrochloride induced apoptosis by Hoechst staining; Sinomenine hydrochloride significantly increased death receptors (DR4 and DR5) protein expression in a concentration-dependent manner in human HCC SMMC-7721 cells.Conclusion Sinomenine hydrochloride can inhibit growth of human HCC SMMC-7721 cells through apoptotic induction; Sinomenine hydrochloride can increase the expression levels of death receptors (DR4 and DR5) on the process of apoptosis induced by Sinomenine hydrochloride in HCC SMMC-7721 cells.

Hepatocellular carcinoma; SMMC-7721; DR4/DR5; Sinomenine hydrochloride; Apoptosis

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF55)；陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK0786)

張俊，碩士，研究方向：慢性肝病和肝癌的發(fā)病機(jī)制與防治。E-mail：zhang08doctor@163.com

任牡丹，在職博士，主治醫(yī)師，研究方向：慢性肝病和肝癌的發(fā)病機(jī)制與防治。E-mail：rmd206@sohu.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.009

R735.7

A

1006-5709(2016)08-0873-04

2015-11-17