李天然，黃曉斌，宋 斌，盧光明，李延軍

1． 解放軍第304醫(yī)院放射科，北京 100048； 2. 解放軍第九五醫(yī)院放射科； 3. 解放軍南京總醫(yī)院醫(yī)學影像科

BMSC對經基因沉默肝癌組織的影響

李天然1，黃曉斌2，宋 斌2，盧光明3，李延軍3

1． 解放軍第304醫(yī)院放射科，北京 100048； 2. 解放軍第九五醫(yī)院放射科； 3. 解放軍南京總醫(yī)院醫(yī)學影像科

目的 觀察BMSC對經基因改造的具有不同轉移潛能肝癌的影響。方法 63只裸鼠隨機分成8組:MHCC97-L組(9只)、MHCC97-L NC組(8只)、MHCC97-L OPN沉默組(8只)、MHCC97-L TGFβ1沉默組(5只)、MHCC97-H組(8只)、MHCC97-H NC組(8只)、MHCC97-H OPN沉默組(9只)、MHCC97-H TGFβ1沉默組(8只)。 腫瘤體積50 mm3左右開始瘤內注射人間充質干細胞BMSC，1×105/只，每周2次，連續(xù)4 周。計算瘤體積抑制率(%)和瘤重抑制率(%)，BMSC對經基因沉默的肝癌動物模型干預結果進行病理檢測。結果 與MHCC97-L組比，BMSC對MHCC97-L NC組瘤體積和瘤重均有促進作用，與MHCC97-L組比，BMSC對MHCC97-L OPN沉默組瘤體積和瘤重均有明顯的抑制作用，而BMSC對MHCC97-L TGFβ1沉默組瘤體積和瘤重均有促進作用。與MHCC97-H組比，BMSC對MHCC97-H NC組瘤體積和瘤重均有輕度抑制作用，與MHCC97-H組比，BMSC對MHCC97-H OPN沉默組和MHCC97-H TGFβ1沉默組瘤體積和瘤重均有顯著的抑制作用。與MHCC97-H組及MHCC97-H NC組比較，MHCC97-H OPN沉默組纖維增生及核分裂象較少，而MHCC97-H TGFβ1沉默組纖維增生明顯，核分裂象較多。與MHCC97-L比較，MHCC97-L NC、MHCC97-L OPN沉默組、MHCC97-L TGFβ1沉默組見較多壞死區(qū)、較多腫瘤細胞凋亡、壞死，并可見數個核分裂象。結論 抑制腫瘤OPN表達BMSC可更好地抑制腫瘤的增殖，而抑制腫瘤TGFβ1表達BMSC并不能抑制腫瘤的增殖。相應的抗體沉默OPN可能是治療腫瘤的一個比較好的靶點，配合BMSC生物治療會提高治療的生物效能。

肝癌；骨髓間充質干細胞；轉移；骨橋蛋白；腫瘤生長轉化因子

目前基于自體骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)的生物治療是比較有前景的生物治療手段，相應的基礎研究也從多方面展開[1]。然而，BMSC對腫瘤的干預效能仍然存在許多不確定的方面，如干細胞的成瘤性、干細胞長時間的干預效能、干細胞對腫瘤生物學行為的影響等需要進一步研究和觀察[2]。本課題研究組前期通過基因工程技術對BMSC進行改造，使其增加轉移性相關基因骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)、腫瘤增殖性基因腫瘤生長因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)的表達，觀察經基因修飾的BMSC對具有不同轉移潛能肝癌的影響情況，研究結果顯示外源性生物因子可以促進腫瘤細胞的增殖和轉移[3-4]。在此基礎上，對具有高低轉移潛能的肝癌細胞中轉移相關基因OPN和腫瘤增殖相關基因TGFβ1進行沉默(SiRNA)，觀察BMSC對經基因修飾的肝癌細胞影響，下一步尋找合適的抑制肝癌轉移和增殖的目的基因，為基于BMSC的生物治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及試劑 電子天平(上海天平儀器廠，F(xiàn)A1104型)，超低溫冰箱(青島海爾集團，型號：BS-812)，凈化工作臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，SW-CJ-2D型)。0.9%氯化鈉注射液：浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司，批號：130629-2。

1.2 動物飼料

1.2.1 維持飼料：由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，執(zhí)行標準GB14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》。

1.2.2 實驗動物及飼養(yǎng)條件：實驗用BALB/c雄性裸小鼠均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號為SCXK(滬)2012-0002，SPF級，動物質量合格證號為0205939，購入時動物體質量為20 g左右。飲用水為滅菌二級超純水，飲用水質量符合中華人民共和國國家標準《生活飲用水衛(wèi)生標準》 (GB5749-2006)的規(guī)定。實驗動物房使用許可證號為SYXK(浙)2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。裸小鼠實驗前在動物房環(huán)境中適應6 d。

1.3 實驗方法

1.3.1 高低轉移潛能肝癌動物模型分組： 63只裸鼠隨機分成8組：MHCC97-L組(9只)、MHCC97-L NC組(8只)、MHCC97-L OPN沉默組(8只)、MHCC97-L TGFβ1沉默組(5只)、MHCC97-H組(8只)、MHCC97-H NC組(8只)、MHCC97-H OPN沉默組(9只)、MHCC97-H TGFβ1沉默組(8只)。

1.3.2 高低轉移潛能肝癌動物模型制作方法： 收集處于對數生長期的各組細胞株，1 000 r/min 離心5 min，調整細胞濃度至 2.5×107個/ml，制備單細胞懸液。63只裸鼠分別自右側腋下接種相應組別細胞懸液0.2 ml，含細胞數 5×106個/只，注射后注射部位局部按壓30 s，防止細胞懸液從針孔流出。注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，復制皮下移植瘤模型。

1.3.3 BMSC干預動物方法：腫瘤體積50 mm3左右開始瘤內注射人骨髓間充質干細胞BMSC，1×105/只，每周2次，連續(xù)4 周。

1.4 指標檢測方法 各組裸鼠于細胞接種后1 周開始稱重并測量瘤塊體積，1 周3 次，用游標卡尺測量瘤體的最長徑(a)和最短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V(cm3)= 1/2ab2=0.5ab2， 繪制腫瘤生長曲線。動物體質量：1 周3 次測量動物總體質量，動物體質量=總體質量-腫瘤體積(假設腫瘤密度為1)。計算：

瘤體積抑制率(%)=(1-實驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積)×100%；瘤重抑制率(%)=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。實驗結束后處死動物， 分別稱體質量和瘤重，4%甲醛固定，用于病理檢測。

2 結果

2.1 一般性觀察結果 裸鼠接種第13天，腫瘤體積>50mm3，開始進行瘤內注射人BMSC細胞進行干預。移植瘤模型建立初期，各組裸鼠的飲食、大小便、行為和精神狀態(tài)無明顯差異。隨著實驗進行，各組裸鼠皮下腫瘤逐漸增大，MHCC97-LOPN沉默組與MHCC97-L組比較，MHCC97-HOPN沉默組、MHCC97-HTGFβ1沉默組與MHCC97-H組比較均有明顯抑制效果。實驗結束處死各組裸鼠并剝離瘤體，可見瘤體與周圍組織界限清晰，與皮膚和皮下結締組織輕微粘連，包膜完整。

2.2BMSC干預經基因修飾前后具有不同轉移潛能肝癌皮下移植瘤模型腫瘤生長體積和腫瘤重量變化

2.2.1 經BMSC細胞干預腫瘤至腫瘤接種后第40天，處死動物，對瘤體體積和重量進行統(tǒng)計，結果顯示，BMSC對經OPN基因沉默的MHCC97-L動物模型腫瘤體積明顯縮小，但腫瘤的重量無明顯變化。而BMSC對經TGFβ1基因沉默的MHCC97-L腫瘤體積和重量抑制作用不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

與MHCC97-H及MHCC97-HNC組比較，經OPN、TGFβ1沉默的MHCC97-H腫瘤體積縮小明顯，而相應腫瘤重量反而增加(P<0.01，見表2)。

腫瘤體積(mm3)腫瘤重量(g)MHCC97?L2611．36±883．8721．07±1．23MHCC97?LNC3010．30±596．4222．43±2．30MHCC97?LOPN582．33±322．51???22．86±2．32MHCC97?LTGFβ12754．90±1909．5320．85±4．11

注：與其他3組比較，***P<0.001。

腫瘤體積(mm3) 腫瘤重量(g) MHCC97?H3064．90±821．7820．52±3．32MHCC97?HNC2776．62±704．3618．90±1．87MHCC97?HOPN1200．25±181．59??23．72±2．53??MHCC97?HTGFβ1595．83±343．83???23．34±2．23??

注：與其他3組比較，***P<0.001；與MHCC97-H和MHCC97-H NC組比較，**P<0.01。

2.2.2 截至到腫瘤接種后第40天，經BMSC細胞干預高低不同轉移潛能肝癌動物模型各個時間點平均腫瘤體積和重量進行統(tǒng)計分析，由圖1可見，MHCC97-H OPN和MHCC97-H TGFβ1沉默組與MHCC97-H組和MHCC97-H NC組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明BMSC對經基因修飾的MHCC97-H OPN和MHCC97-H TGFβ1沉默組的腫瘤體積具有明顯的抑制作用。由圖2可見，BMSC對經OPN基因修飾的MHCC97-H腫瘤模型重量具有促進作用(P<0.001)，而對經TGFβ1基因修飾的MHCC97-H腫瘤模型重量無明顯抑制作用。

由圖3、圖4可見，BMSC對經OPN基因沉默的MHCC97-L腫瘤體積具有明顯的抑制作用，BMSC對經基因修飾的MHCC97-L腫瘤模型瘤重具有促進作用(P<0.001)。

注：與MHCC97-H TGFβ1和MHCC97-H OPN組比較,***P<0.01,**P<0.05。

圖1 BMSC干預MHCC97-H腫瘤40 d平均腫瘤體積比較直方圖

Fig 1 Comparison of the mean tumor volume of MHCC97-H after intervention 40 days by BMSC,

注：與MHCC97-H 和MHCC97-H NC組比較,***P<0.01。

注：與其他3組比較，***P<0.01。

注：與其他3組比較，***P<0.01。

2.3 肝癌腫瘤抑制率計算結果 抑制率包括：腫瘤體積抑制率、腫瘤重量抑制率。抑制率計算去除各種干擾因素，作為BMSC對肝癌組織作用的最終評判，結果如表3所示，與MHCC97-L組比，BMSC對MHCC97-L NC組瘤體和瘤重均有促進作用，與MHCC97-L組比

表3 BMSC對具有高低轉移潛能肝癌經基因修飾前后抑制率分析(%)

Tab 3 Inhibitory rate of BMSC on hepatocellular carcinoma with high and low metastatic potential before and after gene modification (%)

瘤體抑制率瘤重抑制率MHCC97?L組0．000．00MHCC97?LNC組-15．28-4．74MHCC97?LOPN組77．7051．28MHCC97?LTGFβ1組-5．50-73．58MHCC97?H組0．000．00MHCC97?HNC組9．414．99MHCC97?HOPN組60．8447．23MHCC97?HTGFβ1組80．5684．08

較，BMSC對MHCC97-L OPN沉默組瘤體和瘤重均有明顯的抑制作用，而BMSC對MHCC97-L TGFβ1沉默組瘤體和瘤重均有促進作用。與MHCC97-H組比，BMSC對MHCC97-H NC組瘤體和瘤重均有輕度抑制作用，與MHCC97-H組比，BMSC對MHCC97-H OPN沉默組和MHCC97-H TGFβ1沉默組瘤體和瘤重均有顯著的抑制作用。

2.4 BMSC對經基因修飾前后的具有不同轉移潛能的肝癌動物模型干預結果病理 MHCC97-H組和MHCC97-H NC組可見較多腫瘤壞死區(qū)，纖維增生明顯，核分裂象較多。與MHCC97-H組和MHCC97-H NC組比較，MHCC97-H OPN沉默組纖維增生及核分裂象較少，而MHCC97-H TGFβ1沉默組纖維增生明顯，核分裂象較多(見圖5)。

與MHCC97-L組比較，MHCC97-L NC組、MHCC97-L OPN沉默組、MHCC97-L TGFβ1沉默組見較多壞死區(qū)，較多腫瘤細胞凋亡、壞死，并可見數個核分裂象(見圖6)。

圖5 BMSC對基因沉默前后肝癌組織干預病理結果(HE染色 200×) A：MHCC97-H組；B：MHCC97-H NC組；C：MHCC97-H OPN沉默組；D：MHCC97-H TGFβ1沉默組

Fig 5 BMSC on the gene silencing before and after the intervention of HCC tissue pathology results (HE staining 200×) A: MHCC97-H blank control group; B: MHCC97-H gene silencing negative control group;C: MHCC97-H OPN gene silence group; D: MHCC97-H TGFβ1 silence group

圖 6 BMSC對基因沉默前后肝癌組織干預病理結果(HE染色 200×) A：MHCC97-H組；B：MHCC97-H NC組；C：MHCC97-H OPN組；D：MHCC97-H TGFβ1沉默組

Fig 6 BMSC on the gene silencing before and after the intervention of HCC tissue pathology results (HE staining 200×) A: MHCC97-H blank control group; B: MHCC97-H gene silencing negative control group; C: MHCC97-H OPN gene silence group; D: MHCC97-H TGFβ1 silence group

3 討論

干細胞技術可分為正常干細胞技術和癌干細胞技術。正常干細胞技術(normal stem cells, NSCs)指利用人體正常的干細胞進行腫瘤的干預技術，觀察人體正常干細胞對腫瘤組織或腫瘤細胞的作用。BMSC移植對腫瘤治療是比較有前景的手段，對肝臟疾病，自體骨

髓干細胞具有生成肝細胞和膽管細胞的能力，容易采集，可避免移植排斥反應，移植過程簡單易行、治療費用低廉、不違反醫(yī)學倫理道德等優(yōu)點而成為肝癌生物治療的熱點研究內容[5-6]。

有研究已經證實，骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)是一種分泌型磷酸化糖蛋白，其分子結構中含有RGD(Arg-Gly-Asp)多肽序列。OPN主要通過與其受體整合素和CD44相互作用，參與腫瘤轉移的多個過程[7]。前期我們研究表明，外源性OPN通過抑制MHCC97-H細胞釋放內源性OPN而發(fā)揮促進腫瘤侵襲的作用，主要通過激活MMP-2因子發(fā)揮作用[3]。另外， TGFβ1是參與腫瘤的增殖、侵襲轉移重要生物因子。TGFβ1因子與整合素αvβ3受體在腫瘤轉移相關信號通路上具有聯(lián)系，即整合素與TGFβ1受體介導的兩條信號傳導通路不僅共用某些信號分子，而且共同作用于多種生物效應并相互促進[8]。本課題組注意到前期研究還發(fā)現(xiàn)， TGFβ1與腫瘤的增殖行為有關，在高低轉移潛能肝癌細胞也存在差異[4]。基因修飾是腫瘤研究中常見的手段與方法，為觀察BMSC對肝癌的作用效能，本研究通過基因工程技術手段，分別沉默(siRNA)高低轉移潛能肝癌細胞中OPN和TGFβ1兩種基因，使之減少表達OPN、TGFβ1生物活性因子，通過與BMSC共培養(yǎng)觀察對其轉移潛能和增殖潛能的影響。

本研究抑制率結果發(fā)現(xiàn)，經OPN基因沉默的高低轉移潛能肝癌動物模型，BMSC干預后其腫瘤體積和腫瘤重量均具有明顯的抑制作用，大體病理結果證實，與對照組比較腫瘤的壞死成分增多，核分裂象減少，纖維成分增多，腫瘤組織中成分的變化是造成腫瘤體積和重量受抑制的原因。這也表明，OPN在腫瘤組織中的作用，OPN的減少促進了細胞的凋亡，延緩了腫瘤細胞的增殖，促進了纖維組織的增生。本研究對肝癌細胞另一個生物活性因子TGFβ1進行基因沉默，使肝癌組織低表達TGFβ1因子，BMSC經對具有高低轉移潛能肝癌腫瘤動物模型進行干預實驗結果顯示，對低轉移潛能肝癌(MHCC97-L)腫瘤的體積及重量均有促進作用，相應的病理結果顯示有較多壞死區(qū)、較多腫瘤細胞凋亡、壞死。而BMSC對高轉移潛能肝癌(MHCC97-H)腫瘤的體積和腫瘤重量具有明顯的抑制作用，病理結果顯示經TGFβ1沉默組腫瘤中纖維組織增生明顯，可以解釋對腫瘤體積和瘤重的促進作用，這也表明TGFβ1具有促進腫瘤細胞增殖的作用，經基因沉默后，促進腫瘤細胞增殖作用減弱，取而代之纖維組織增生明顯，這與文獻報道的TGFβ1功能相一致[9]。

分子生物學研究表明，TGFβ1、OPN與整合素αvβ3之間存在明顯的關系，整合素與細胞外基質(ECM)黏附的過程中，OPN介導作用機制，TGFβ1通過上調整合素關聯(lián)蛋白激酶(Integrin-linked kinase, IKL)的表達而激活蛋白激酶B這一信號通路，TGFβ1提高黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)酪氨酸的磷酸化水平，激活下游的信號分子直接或間接地影響肝癌侵襲和轉移[10]。

BMSC對腫瘤的干預效能存在不同的研究結果[2]，這種差異可能與腫瘤微環(huán)境有關，多種因子可能參與BSMC對腫瘤的干預。本研究中TGFβ1、OPN兩種生物因子參與了腫瘤的增殖和轉移，通過對兩種因子的抑制，BMSC干預效能出現(xiàn)差異，抑制腫瘤OPN表達BMSC可更好地抑制腫瘤的增殖，而抑制腫瘤TGFβ1表達BMSC并不能抑制腫瘤的增殖。由此可見，相應的抗體沉默OPN可能是治療腫瘤的一個比較好的靶點，配合BMSC生物治療會提高治療的生物效能。

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(責任編輯：王全楚)

Effect of BMSC on hepatocellular carcinoma tissues by gene interference

LI Tianran1, HUANG Xiaobin2, SONG Bin2, LU Guangming3, LI Yanjun3

1. Department of Radiology, 304th Hospital of Chinese PLA, Beijing 100048; 2. Department of Radiology, 95th Hospital of Chinese PLA; 3. Department of Radiology, Nanling General Hospital of Chinese PLA, China

Objective To observe the effect of BMSC on hepatocellular carcinoma (HCC) with different metastatic potential by gene interference.Methods Sixty-three nude mice were randomly divided into eight groups, including MHCC97-L blank control group (9 nude mice), MHCC97-L gene negative control group (8 nude mice), MHCC97-L OPN gene interference group (8 nude mice), MHCC97-L TGFβ1 gene interference group (5 nude mice )and MHCC97-H blank control group (8 nude mice), MHCC97-H gene negative control group (8 nude mice), MHCC97-H OPN gene interference group (9 nude mice), MHCC97-L TGFβ1 gene interference group (8 nude mice). When tumor volume grown to 50 mm3, human mesenchymal stem cells (BMSC) was injected, and 1×105/one, two times a week, for 4 weeks. Tumor volume inhibition rate (%) and tumor weight inhibition rate (%) were calculated, and pathological test was used for HCC animal model with gene silencing.Results Compared with the MHCC97-L blank control group, BMSC could promote the tumor volume and tumor weight of MHCC97-L NC group, and could inhibit tumor volume and tumor weight of MHCC97-L OPN gene interference group. However, BMSC could promote the tumor volume and tumor weight of MHCC97-L TGFβ1 gene interference group. Compared with the MHCC97-H blank control group, BMSC could mildly inhibit the tumor and tumor weight of MHCC97-H gene negative control group, and could inhibit tumor volume and tumor weight of MHCC97-H OPN and TGFβ1 gene interference groups. Compared with MHCC97-H blank control group and MHCC97-H gene negative control group, the fiber proliferation and nuclear division of MHCC97-H OPN gene interference group were less, while the MHCC97-H TGFβ1 gene interference group had obvious fiber hyperplasia and more nuclear division. Compared with MHCC97-L blank control group,MHCC97-L gene negative control group, MHCC97-L OPN gene interference group and MHCC97-L TGFβ1 gene interference group could see more necrotic areas, more tumor cell apoptosis, necrosis, and can be seen a number of mitotic figures.Conclusion Inhibition of tumor OPN expression BMSC may be better able to inhibit tumor proliferation, while inhibition of tumor TGFβ1 expression BMSC did not inhibit tumor proliferation. The corresponding antibody silencing OPN may be a good target for the treatment of tumors, the BMSC biological treatment will improve the biological efficacy of treatment.

HCC; BMSC; Metastasis; OPN; TGFβ1

國家自然科學基金資助項目( 81271607) ;南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生重點項目資助(11Z035); 國家博士后基金(2015M572810)

李天然，博士，2012 年北京大學醫(yī)學部博士后，副主任醫(yī)師，研究方向：肝癌分子影像學研究。E-mail: lizhaoruixin@sina.com

宋斌，E-mail: ltranmd@yeah.net

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.005

論著·肝癌

R735.7

A

1006-5709(2016)08-0860-05

2016-01-11