任 佳,姚 宏,劉苗苗*,張 昱,楊 敏(.北京交通大學(xué)土木建筑工程學(xué)院市政環(huán)境工程系,水中典型污染物控制與水質(zhì)保障北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 00044；.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 00085)

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厭氧和好氧處理過(guò)程中四環(huán)素抗藥基因的豐度

任 佳1,姚 宏1,劉苗苗1*,張 昱2,楊 敏2(1.北京交通大學(xué)土木建筑工程學(xué)院市政環(huán)境工程系,水中典型污染物控制與水質(zhì)保障北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100044；2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100085)

摘要：為了了解抗生素生產(chǎn)廢水不同處理過(guò)程(厭氧生物處理和好氧生物處理)中抗藥基因的行為,本文以兩種四環(huán)素(土霉素、金霉素)生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)為調(diào)查對(duì)象,采用PCR和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)方法考察厭氧和好氧處理過(guò)程中常見(jiàn)的6種四環(huán)素抗藥基因(tet(A), tet(C), tet(G), tet(Q), tet(W), tet(X))及2種轉(zhuǎn)移因子(I型整合子intI1, 異常插入序列ISCR3)的豐度特征.結(jié)果表明,tet(C)在所有樣品中均未檢出,其它基因在所有樣品中檢出.四環(huán)素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥中tet(A)、tet(G)、tet(X)的相對(duì)豐度(與16S rRNA基因的比值)范圍為(1.25±0.16)×10-4～(4.52±0.002)×10-2,顯著低于好氧污泥[(9.88±0.67)×10-5～(2.70±0.29)×10-1],而tet(Q)、tet(W)在厭氧污泥中的相對(duì)豐度為(1.66±0.03)×10-2～(7.48±1.22)×10-2,比好氧污泥中[(1.94±0.12)×10-3～(2.85±0.16)×10-2]高1個(gè)數(shù)量級(jí);轉(zhuǎn)移因子intI1和ISCR3在厭氧污泥中相對(duì)豐度范圍為(1.48±0.01)×10-3～(2.61±0.31)×10-2,顯著低于好氧污泥[(1.18±0.15)×10-1～(8.99±0.75)×10-1],表明厭氧處理過(guò)程中由這兩種轉(zhuǎn)移因子介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移潛力較小.研究表明,好氧處理促進(jìn)了tet(A)、tet(G)、tet(X)的傳播,但對(duì)tet(Q)和tet(W)有控制效果,而厭氧處理過(guò)程與之相反.抗藥基因的分布與水平轉(zhuǎn)移因子、抗藥機(jī)制、群落結(jié)構(gòu)有關(guān).

關(guān)鍵詞：四環(huán)素生產(chǎn)廢水；四環(huán)素抗藥基因；轉(zhuǎn)移因子；厭氧處理；好氧處理

* 責(zé)任作者, 講師, lmmhit@163.com

隨著抗生素的大量生產(chǎn)和廣泛使用,其在環(huán)境中的殘留被頻繁檢出.抗生素殘留會(huì)誘導(dǎo)抗藥菌和抗藥基因的產(chǎn)生和增殖,威脅公共健康[1].人們已在污水處理廠[2]、養(yǎng)殖水域[3]、河流[4-5]、沉積物[5]和土壤[6-7]等環(huán)境中檢測(cè)出抗藥基因和抗藥菌.近年來(lái),在中國(guó)、印度等地開(kāi)展的研究發(fā)現(xiàn),抗生素生產(chǎn)廢水中有很高的抗生素殘留[8-9],遠(yuǎn)高于其它環(huán)境,如城市污水廠、河流等.

抗生素生產(chǎn)廢水是一種高濃度有機(jī)廢水,目前主要采用生物法進(jìn)行處理.由于該系統(tǒng)中抗生素濃度高,選擇壓力大,同時(shí)微生物數(shù)量多,已成為抗藥基因的重要污染源[8,10-11].從某土霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)篩選的細(xì)菌中,94.2%攜帶四環(huán)素類抗藥基因(tet基因)[9].定量研究發(fā)現(xiàn),該系統(tǒng)中tet抗藥基因的相對(duì)豐度比城市污水廠高1～4個(gè)數(shù)量級(jí)[12].從某青霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)篩選的細(xì)菌中,17.3%(31/179)攜帶有β-內(nèi)酰胺類抗藥基因[13].某螺旋霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中檢測(cè)出8種大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽(yáng)菌素(MLS)抗藥基因,其豐度比城市污水廠高1.4～2.3個(gè)數(shù)量級(jí)[14].

迄今為止,關(guān)于不同處理工藝中抗藥基因的差別已有一些報(bào)道,但尚未發(fā)現(xiàn)一致規(guī)律.某螺旋霉素生產(chǎn)廢水厭氧污泥中MLS抗藥基因的相對(duì)豐度低于好氧污泥[14].Tao等[15]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬廢水處理過(guò)程中,tet(A)和tet(W)在厭氧污泥中的相對(duì)豐度高于好氧污泥.此外,在某制革廢水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn),磺胺類抗藥基因(sul1和sul2)、四環(huán)素抗藥基因(tet(G),tet(X))在厭氧污泥中豐度低于好氧污泥;四環(huán)素抗藥基因tet(M),tet(C)在厭氧污泥中豐度高于好氧污泥[16].Christgen等[17]比較了城市污水厭氧、好氧、厭氧-好氧處理過(guò)程中抗藥基因在水相中的去除情況,發(fā)現(xiàn)厭氧-好氧聯(lián)合處理具有最高的去除效果,但經(jīng)過(guò)好氧處理后,抗藥基因的比例升高.在城市污水廠剩余污泥消化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),厭氧消化對(duì)抗藥基因的控制效果優(yōu)于好氧消化[18].不同處理工藝中抗藥基因的行為和機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步研究.

本文以內(nèi)蒙古某金霉素和某土霉素制藥廠生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)(厭氧-好氧組合工藝)為對(duì)象,使用PCR、實(shí)時(shí)定量PCR等方法調(diào)查了進(jìn)水、出水、厭氧污泥、好氧污泥中tet基因的種類及豐度,比較了厭氧和好氧處理過(guò)程中tet基因的差異,分析了進(jìn)水和出水中tet基因的變化,預(yù)期從抗藥基因控制角度為選擇制藥廢水處理工藝提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

表1 樣品信息及采樣編號(hào)Table 1 Sample information and number

于2013年7～12月對(duì)內(nèi)蒙古某金霉素和某土霉素制藥廢水處理系統(tǒng)進(jìn)行了1～2次采樣.土霉素制藥廠(K廠)的土霉素產(chǎn)量為5000t/y,該廢水處理系統(tǒng)采用UASB + 生物接觸氧化池工藝;金霉素制藥廠(J廠)的金霉素產(chǎn)量為41500t/y,該廢水處理系統(tǒng)采用UASB + AO + CASS工藝.采集的樣品包括:處理系統(tǒng)的進(jìn)水、出水;厭氧和好氧生物處理單元的活性污泥.此外以大豆蛋白發(fā)酵廢水處理系統(tǒng)為對(duì)照體系,該系統(tǒng)采用UASB +SBR處理工藝.每次采樣持續(xù)3d,每個(gè)采樣點(diǎn)每天取3個(gè)平行樣并均勻混合.對(duì)于污水和污泥樣品,分別取100mL和1mL樣品,4℃下10000r/min離心10min,將沉積物保存到-20℃,用于DNA提取.具體樣品編號(hào)及采樣信息見(jiàn)表1.

1.2 水樣分析

按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》[19]國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分析常規(guī)化學(xué)指標(biāo),測(cè)定了水樣的CODCr,氨氮,TP和TOC,測(cè)定均有3個(gè)平行,最后計(jì)算平均值.通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/ MS,Waters,USA)對(duì)系統(tǒng)中的土霉素、金霉素進(jìn)行定量分析[9].

1.3 DNA提取及PCR

對(duì)于離心收集到的污水和污泥樣品,使用Fast DNA Spin Kit for soil (MpBio,美國(guó))提取DNA.選取了6種tet基因(外排泵類tet(A)、tet(C)、tet(G)、核糖體保護(hù)類tet(Q)、tet(W)、酶修飾tet(X))[20]和2種轉(zhuǎn)移因子(intI1和ISCR3)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增反應(yīng)采用50μL體系,包括5μL 10×PCR buffer、4μL dNTPs、20pmol/L上下游引物各1μL、1.25U Taq酶0.25μL、1μL 20mg/L牛血清蛋白溶液、37μL無(wú)菌水以及1μL DNA模板.樣品DNA濃度范圍為79.3～120.8ng/μL,稀釋10倍作為PCR模板,陰性對(duì)照以無(wú)菌水作為DNA模板.反應(yīng)條件為95℃解鏈7min;95℃解鏈35s,退火35s,72℃延伸45s(循環(huán)35次);72℃延伸10min,不同tet基因的引物及退火溫度見(jiàn)文獻(xiàn)[3,12].PCR產(chǎn)物通過(guò)1%(質(zhì)量/體積)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn).

1.4 qPCR

對(duì)于普通PCR檢出的5種tet基因[tet(A)、tet(G)、tet(Q)、tet(W)、tet(X)]、2種轉(zhuǎn)移因子及細(xì)菌的總16S rRNA基因進(jìn)行拷貝數(shù)定量分析,實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2>0.99,擴(kuò)增效率均在90%～110%的范圍內(nèi).詳細(xì)操作方法如下:使用GeneJET Gel Extraction Kit(天根,北京)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化.將純化的PCR產(chǎn)物與載體質(zhì)粒PMD 18-T Vector(Takara,大連)在16℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化到E.coil TOP10感受態(tài)細(xì)胞(Takara,大連)中擴(kuò)大培養(yǎng)后涂平板,每個(gè)樣品隨機(jī)挑選30個(gè)白色菌落,用載體質(zhì)粒引物M13進(jìn)行PCR檢測(cè),每種基因選擇1～2株陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序.將克隆測(cè)序得到的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比較,確定是目標(biāo)基因片段后,用TIANprep Mini Plasmid Kit(天根,北京)提取質(zhì)粒,作為定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)模板.使用ABI 7300 SYBR-Green實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI,美國(guó))對(duì)tet基因、轉(zhuǎn)移因子和細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行定量.反應(yīng)采用25μL體系,包括1×SYBR Green I, 1×Dye(Takara,大連),200nM上下游引物各1μL, 0.5mg/mL牛血清蛋白,2 μL DNA模板.對(duì)于16S rRNA和ISCR3,溫度程序?yàn)?95℃,30s;95℃,10s,退火溫度,35s,循環(huán)40次;并于退火溫度下收集熒光信號(hào);自動(dòng)熔解曲線過(guò)程.對(duì)于其他基因,溫度程序?yàn)?95℃,30s;95℃,10s;退火溫度,10～15s;72℃, 10s;78～83℃,26s(收集熒光信號(hào));循環(huán)40次;自動(dòng)熔解曲線過(guò)程.定量PCR的退火溫度均比普通PCR高3～5℃.

將克隆測(cè)序得到的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋10～108倍,作為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品作為定量PCR模板時(shí),進(jìn)行適當(dāng)稀釋(10～100倍),并以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照.所有樣品均3個(gè)平行,最終計(jì)算平均值.不同樣品之間由于生物量及DNA提取效率不同,論文中將得到的抗藥基因和轉(zhuǎn)移因子的豐度對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行歸一化,采用tet基因和轉(zhuǎn)移因子的相對(duì)豐度(tet基因和轉(zhuǎn)移因子的拷貝數(shù)/16S rRNA基因的拷貝數(shù))進(jìn)行分析討論.

2 結(jié)果與討論

2.1 廢水水質(zhì)

土霉素及金霉素制藥廠廢水處理系統(tǒng)常規(guī)物理化學(xué)指標(biāo)見(jiàn)表2.

K廠進(jìn)水中土霉素濃度為25.4mg/L,UASB出水中土霉素濃度為23.1mg/L,生物接觸氧化池出水中土霉素濃度為1.1mg/L,該系統(tǒng)中土霉素濃度高于城市污水廠(0.06～1.10μg/L)[20];J廠進(jìn)水中金霉素濃度為100mg/L,可能由于金霉素水解周期短[21],在各級(jí)出水中均未檢出金霉素.總的來(lái)看,K廠和J廠廢水處理系統(tǒng)中的抗生素濃度高于城市污水廠[22].

表2 兩種四環(huán)素生產(chǎn)廢水的化學(xué)指標(biāo)Table 2 Chemical characteristics of the two tested tetracycline production wastewater

2.2 tet基因及轉(zhuǎn)移因子PCR檢測(cè)

采集的各樣品提取DNA后,用PCR擴(kuò)增檢測(cè)6種tet基因及2種轉(zhuǎn)移因子的出現(xiàn),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3.據(jù)表3可以看出,比較選擇的6種tet基因以及2種轉(zhuǎn)移因子,在抗生素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中,除tet(C)沒(méi)有檢出外,其他均有檢出,且tet(A)、tet(Q)、ISCR3和intI1在所有樣品中均被檢出,表明該系統(tǒng)中抗藥基因普遍存在.而在大豆蛋白廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥中只檢出核糖體保護(hù)類tet(Q)和tet(W),好氧污泥中則只有外排泵類tet(A)、tet(C)未被檢出.

表3 PCR檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of PCR detection

2.3 tet基因及轉(zhuǎn)移因子的豐度

土霉素廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥(K1)中tet基因的豐度范圍為(1.73±0.04)×10-4～(4.52±0.02)× 10-2;好氧污泥(K2)中tet基因的豐度范圍為: (2.91±0.05)×10-3～(2.70±0.29)×10-1;金霉素廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥(J1, J1’)中tet基因的豐度范圍為:(1.25±0.16)×10-4～(5.70±0.001)×10-2;好氧污泥(J2, J2’, J3’)中tet基因的豐度范圍為: (9.88± 0.67)×10-5～(1.38±0.41)×10-1.但不同抗藥基因在厭氧和好氧污泥中的分布不同,因此需要更全面的調(diào)查研究.大豆蛋白生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥(C1)中tet基因的豐度范圍為:(6.84±0.87)×10-6～(1.82±0.13)×10-2;好氧污泥(C2)中tet基因的豐度范圍(4.64±0.19)×10-5～(1.66±0.09)×10-2.對(duì)于兩種轉(zhuǎn)移因子,四環(huán)素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)活性污泥中,intI1的豐度范圍為(3.99±0.14)× 10-3～(8.99±0.75)×10-1; ISCR3的豐度范圍為(1.48±0.08)×10-3～(1.81± 0.13)×10-1,均高于大豆蛋白生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng),豐度范圍分別為(1.84± 0.27)×10-4～(1.46±0.18)×10-2和(1.96±0.11)×10-4～(1.30±0.11)×10-3.抗生素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中抗藥基因和轉(zhuǎn)移因子豐度比大豆蛋白廢水處理系統(tǒng)高1～3個(gè)數(shù)量級(jí),表明高濃度的抗生素殘留水平促進(jìn)抗藥基因的產(chǎn)生和增殖.

為了進(jìn)一步闡明厭氧生物處理和好氧生物處理過(guò)程中抗藥基因的差異,著重比較了厭氧污泥和好氧污泥中tet基因以及轉(zhuǎn)移因子的豐度(圖1).3種tet基因tet(A)、tet(G)、tet(X)在厭氧污泥中的豐度[(1.25±0.16)×10-4～(4.52±0.02)× 10-2]比好氧污泥中的豐度[(9.88±0.67)×10-5～(2.70±0.29)×10-1]低1～2個(gè)數(shù)量級(jí),而另外兩種tet基因tet(Q)、tet(W)則是好氧污泥中豐度[(5.76± 0.58)×10-3～(2.85±0.16)×10-2]比厭氧污泥[(1.66± 0.03)×10-2～(7.48±1.22)×10-2]低1個(gè)數(shù)量級(jí).已有研究發(fā)現(xiàn)在城市污水廠活性污泥的厭氧消化過(guò)程中tet(G)、tet(X)的豐度降低,tet(A)、tet(W)的豐度升高[23],由于抗藥基因的分布與細(xì)菌群落有一定的關(guān)系[23],而處理工藝的不同運(yùn)行條件均可能造成微生物群落差異,從而產(chǎn)生不同的抗藥基因分布.此外,江蘇某養(yǎng)豬廢水經(jīng)過(guò)厭氧發(fā)酵后,外排泵類tet基因[tet(A)、tet(C)、tet(G)]豐度下降,核糖體保護(hù)類tet基因[tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W)]豐度升高[24].在本文中,好氧污泥中核糖體保護(hù)類tet基因的豐度較低,而厭氧污泥中外排泵類tet基因的豐度較低.

圖1 四環(huán)素生產(chǎn)廢水系統(tǒng)厭氧污泥和好氧污泥中抗藥基因的相對(duì)豐度Fig.1 The relative abundance of tet genes (normalized to 16S rRNA genes) in the anaerobic and aerobic sludge of tetracycline production wastewater treatment systemsA圖為K廠第1次采樣;B圖為J廠第1次采樣; C圖為J廠第2次采樣

造成不同種tet基因分布差異的原因主要有以下方面.首先,tet基因的分布與其宿主分布可能存在直接聯(lián)系.已有研究表明,革蘭氏陽(yáng)性(G+)細(xì)菌主要攜帶核糖體保護(hù)類tet基因以及少數(shù)幾種外排泵類tet基因[tet(K)、tet(L)、tet(Z)和tet(T)],而革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌則主要攜帶外排泵類tet基因[tet(A)、tet(G)][25].好氧活性污泥中G-細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo),因此導(dǎo)致tet(A)、tet(G)經(jīng)過(guò)好氧處理后豐度甚至升高.而在厭氧活性污泥中,G+細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo),因此導(dǎo)致tet(Q)、tet(W)豐度較高,在好氧處理后豐度降低.

圖2 四環(huán)素抗藥基因和intI1及ISCR3的相關(guān)性分析;intI1與ISCR3的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between tet genes and intI1, tet genes and ISCR3, intI1and ISCR3

其次,轉(zhuǎn)移因子(如整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等)介導(dǎo)的抗藥基因水平轉(zhuǎn)移也會(huì)影響抗藥基因的分布[26].本研究發(fā)現(xiàn)好氧污泥中intI1和ISCR3的豐度比厭氧污泥中的豐度高1～2個(gè)數(shù)量級(jí),intI1 和ISCR3在好氧污泥中的豐度范圍分別為(1.32±0.13)×10-1～(8.99±0.75)×10-1和(1.18±0.29)×10-1～(1.81±0.29)×10-1,高于厭氧污泥中的豐度范圍[(3.9±90.14)×10-3～(2.40±0.07)×10-2和(1.48±0.08) × 10-3～(2.61±0.31)×10-2] (圖1),表明好氧污泥中抗藥基因水平轉(zhuǎn)移的可能性更大.為了進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)移因子對(duì)tet基因分布的影響,對(duì)tet基因和轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)tet(A)、tet(G)、tet(X)均與intI1呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.93,0.71, 0.51,P< 0.05) (圖2A),表明intI1可能在這3種抗藥基因的產(chǎn)生、傳播和增殖中起到重要作用.此外,關(guān)于抗藥基因與intI1相關(guān)性的報(bào)道已有不少,已有研究發(fā)現(xiàn)北京某公園土壤中tet(G)與intI1存在顯著相關(guān)性(R2=0.62;P<0.01),表明intI1可能對(duì)tet(G)的傳播起到促進(jìn)作用[27].

本文首次調(diào)查了制藥廢水中異常插入序列ISCR3的豐度,并通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)tet(A)、tet(G)、tet(X)與ISCR3均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.35,0.70,0.38,P<0.05) (圖2B),且ISCR3與intI1之間也存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2= 0.59,P< 0.05) (圖2C).盡管至今未在intI1的任何基因盒區(qū)域檢測(cè)到tet基因,但目前已發(fā)現(xiàn)整合子可與異常插入元件(insertion sequence common region, ISCR)結(jié)合成為更復(fù)雜的整合子,實(shí)現(xiàn)抗藥基因的共同轉(zhuǎn)移[28].在臨床篩選的抗藥性沙門氏菌中發(fā)現(xiàn),ISCR3與intI1相連形成的復(fù)雜整合子攜帶tet(G)[29].綜上所述,異常插入序列ISCR3和整合子intI1很可能在這3種tet基因的傳播過(guò)程中具有協(xié)同作用,但作用機(jī)理還需要通過(guò)篩菌等方式進(jìn)行進(jìn)一步研究.

與進(jìn)水相比,出水中外排泵類tet基因tet(A)、tet(G)、酶修飾類tet基因tet(X)相對(duì)豐度升高1～2個(gè)數(shù)量級(jí),而核糖體保護(hù)類tet基因的tet(Q)、tet(W)相對(duì)豐度降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)(圖3),抗藥基因總相對(duì)豐度總體降低1個(gè)數(shù)量級(jí),由進(jìn)水中的(4.34±0.24)×10-1降低為出水中的(7.19±0.03)× 10-2.Christgen等[17]使用宏基因組方法調(diào)查了不同處理工藝對(duì)城市污水中抗藥基因去除效果的影響,并比較了不同抗藥機(jī)制的抗藥基因在處理過(guò)程中的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),各種處理均導(dǎo)致出水中外排泵抗藥基因的比例升高;同時(shí),靶位點(diǎn)修飾類抗藥基因(如核糖體保護(hù)類抗藥基因)則在處理之后下降;而酶修飾類抗藥基因在厭氧處理之后比例升高,好氧處理之后比例有所下降.本論文的結(jié)果與之相似,出水與進(jìn)水中tet基因的分布差異也可能與抗藥機(jī)制有關(guān).外排泵類基因[tet(A)、tet(G)]通常與其它抗藥基因(如抗重金屬基因、抗消毒劑基因等)共同存在于轉(zhuǎn)移因子上[30],其存在有助于細(xì)菌群落獲得多抗性,而污水處理系統(tǒng)中殘留的抗生素和重金屬促進(jìn)外排泵類抗藥基因的選擇.

圖3 四環(huán)素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)進(jìn)水和出水中抗藥基因的相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of ARGs (normalized to 16S rRNA genes) in the influent and effluent of tetracycline production wastewater treatment systems

就總體排放風(fēng)險(xiǎn)而言,土霉素和金霉素廢水處理系統(tǒng)中5種tet基因在進(jìn)水中的總絕對(duì)豐度為(1.49±0.26)×109～(2.52±0.17)×109copies/mL,出水中5種tet基因總絕對(duì)豐度降低,總絕對(duì)豐度為(2.06±0.63)×107～(1.42±0.27)×108copies/mL,去除率為94.4%～98.6%.據(jù)報(bào)導(dǎo),某城市污水處理廠進(jìn)水中tet抗藥基因的去除率甚至超過(guò)99.9%[23].Christgen等[17]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)厭氧-好氧組合工藝,水相中抗藥基因的去除率達(dá)到85.3%,但大部分抗藥基因只是從水相轉(zhuǎn)移到污泥相中,并沒(méi)有得到實(shí)質(zhì)性去除.為了進(jìn)一步深入了解污水處理系統(tǒng)對(duì)抗藥基因的削減程度,在后續(xù)研究中有必要對(duì)整個(gè)處理系統(tǒng)(包括污水和污泥)進(jìn)行抗藥基因通量研究.

3 結(jié)論

調(diào)查了兩種四環(huán)素類抗生素(金霉素和土霉素)生產(chǎn)廢水生物處理系統(tǒng)(厭氧-好氧組合工藝)中抗藥基因的產(chǎn)生和排放,比較了厭氧污泥和好氧污泥中抗藥基因及轉(zhuǎn)移因子的分布,并結(jié)合宿主分布和水平轉(zhuǎn)移因子分析了抗藥基因的分布機(jī)理.主要得到以下結(jié)論:金霉素和土霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)的活性污泥和出水中均含有較高豐度的抗藥基因,是重要的抗藥基因污染源和儲(chǔ)存庫(kù).厭氧污泥中,外排泵類和酶修飾類tet基因的豐度較低,而好氧污泥中,核糖體保護(hù)類tet基因的豐度較低,該分布特征與細(xì)菌群落組成、轉(zhuǎn)移因子及抗藥機(jī)制有關(guān).從抗藥基因傳播角度來(lái)看,整合子intI1和異常插入序列ISCR3可能對(duì)某些抗藥基因的傳播起到促進(jìn)作用;好氧處理過(guò)程中抗藥基因通過(guò)這兩種轉(zhuǎn)移因子傳播的可能性更大.

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致謝：本實(shí)驗(yàn)的采樣工作是在課題組左陸珅和王鈺鍇師兄的幫助下完成,在此表示感謝.

Characteristics of tetracycline resistance genes in the anaerobic and aerobic treatment of tetracycline production wastewater.

REN Jia1, YAO Hong1, LIU Miao-miao1*, ZHANG Yu2, YANG Min2(1.Department of Civil Engineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China；2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China).China Environmental Science, 2016,36(1)：268～275

Abstract：In order to understand the characteristics of antibiotic resistance genes (ARGs) in the anaerobic and aerobic treatment processes of two tetracycline production wastewater, the abundances and distribution of six frequently reported tetracycline resistance genes (tet(A), tet(C), tet(G), tet(Q), tet(W), and tet(X)) and two types of mobile elements (intI1and ISCR3) were determined by PCR and quantitative PCR (qPCR).tet(C) was detected in none of the samples, while the others were discovered in all of the samples.In the systems of the tetracycline production wastewater, the relative abundances (normalized to 16S rRNA genes) of tet(A), tet(G), tet(X) in the anaerobic sludge((1.25±0.16)×10-4～(4.52± 0.002)×10-2) were lower than those in the aerobic sludge ((9.88±0.67)×10-5～(2.70±0.29)×10-1), while the relative abundances of tet(Q) and tet(W) in the anaerobic sludge ((1.66±0.03)×10-2～(7.48±1.22)×10-2) were significantly higher than those in the aerobic sludge (1.94±0.12)×10-3～(2.85±0.16)×10-2).Besides, the relative abundances of intI1 and ISCR3 in the anaerobic sludge ((1.48±0.01)×10-3～(2.61±0.31)×10-2) were significantly lower than those in the aerobic sludge ((1.18±0.15)×10-1～(8.99±0.75)×10-1), showing that the potential of horizontal gene transfer mediated by the mobile elements is lower in the anaerobic treatment process.It is indicated that aerobic treatment may facilitate the spread of tet(A), tet(G) and tet(X) but control the spread of tet(Q) and tet(W) in tetracycline production wastewater, with the opposite situation in the anaerobic treatment.The different distribution of tet genes was related to mobile genetic elements, resistancebook=269,ebook=272mechanism, and community structure.

Key words：tetracycline production wastewater；tetracycline resistance genes；mobile elements；anaerobic treatment；aerobic treatment

中圖分類號(hào)：X835

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)01-0268-08

收稿日期：2015-08-31

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(KCJB14046536);環(huán)境模擬與污染控制國(guó)家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(14K01ESPCR);中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(KCI14005531)

作者簡(jiǎn)介：任 佳(1993-),女,山西朔州人,碩士研究生,研究方向?yàn)榄h(huán)境中的抗藥基因污染.