周石磊,黃廷林,白士遠(yuǎn),何秀秀 (西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055)

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貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的分離鑒定及其脫氮特性

周石磊,黃廷林*,白士遠(yuǎn),何秀秀 (西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055)

摘要：為了分離貧營養(yǎng)好氧反硝化菌,研究其系統(tǒng)發(fā)育地位和脫氮特性,以期為微污染水庫水體生物修復(fù)提供依據(jù).從水庫底層沉積物中,采用改良的富集馴化方法分離好氧反硝化菌,通過N-J法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析以及選擇培養(yǎng)基研究其脫氮特性.初篩分離出196株好氧反硝化菌,其中14株為高效菌株(ZHF2、ZHF3、ZHF5、ZHF6、ZHF8、ZMF2、ZMF5、ZMF6、N299、G107、81Y、SF9、SF18和SXF14).經(jīng)形態(tài)學(xué),生理生化,和16S rRNA基因序列分析,ZHF3、ZHF5、ZHF6、ZMF2、G107、81Y、SF18和SXF14為不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.),ZHF2 和ZHF8為新鞘脂菌屬(Novosphingobium sp.),ZMF5為水桿菌屬(Aquabacterium sp.),ZMF6為鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas sp.),N299為動(dòng)膠桿菌屬(Zoogloea sp.),SF9為代爾夫特菌屬(Delftia sp.).其中菌株G107和81Y的反硝化效果最好,72h的硝氮去除率達(dá)到98.88 % 和99.44 %.并以G107和81Y為代表進(jìn)行一系列的脫氮實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示出良好的短程反硝化、硝化和源水脫氮能力.貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的分離,補(bǔ)充和豐富了好氧反硝化菌的種類,其高效的脫氮特性為低氮微污染水體的生物修復(fù)提供了技術(shù)支撐.

關(guān)鍵詞：貧營養(yǎng)；好氧反硝化；分離鑒定；系統(tǒng)發(fā)育；脫氮特性

? 責(zé)任作者, 教授, huangtinglin@xauat.edu.cn

隨著城鎮(zhèn)化和工業(yè)化的快速發(fā)展,大量氮素涌入環(huán)境,使水體氮素嚴(yán)重超標(biāo),特別是飲用水及地表水的硝酸鹽濃度嚴(yán)重超標(biāo).雖然高等植物對(duì)水體的硝氮具有良好的去除效果,但是由于生長周期長、培植成本高、腐敗的植物還可能導(dǎo)致水體的二次污染以及水深的影響,使其現(xiàn)實(shí)的實(shí)際應(yīng)用受到限制[1-2].基于菌粉或菌劑的微生物技術(shù)修復(fù)富營養(yǎng)化水體成為研究熱點(diǎn).單純的硝化作用不能從根本上解決水體總氮超標(biāo)的問題,而反硝化過程是根本上去除水體硝氮的重要途徑[3].但是傳統(tǒng)理論認(rèn)為,反硝化是一個(gè)嚴(yán)格的厭氧過程,在反硝化過程中氧氣會(huì)抑制反硝化酶的活性.同時(shí),在異養(yǎng)反硝化過程中氧氣會(huì)成為優(yōu)先利用的電子受體,因此阻止了硝氮和亞硝氮作為最終電子受體進(jìn)行反硝化脫氮.Robertson等[4]首次從廢水脫硫和反硝化系統(tǒng)中分離出的一株好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha.好氧反硝化菌是利用好氧反硝化酶的作用,在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用的一類反硝化菌.好氧反硝化菌具有獨(dú)特的優(yōu)勢:(1)硝化過程和反硝化過程能在統(tǒng)一體系中進(jìn)行[5];(2)反硝化過程產(chǎn)生的堿能中和硝化過程的酸,維持體系pH值的穩(wěn)定[6];(3)基質(zhì)和異養(yǎng)硝化產(chǎn)物的多樣性實(shí)現(xiàn)了好氧反硝化菌與其他菌種的混合培養(yǎng),擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍[7-9].因好氧反硝化菌的獨(dú)特優(yōu)勢,所以好氧反硝化成為脫氮的一種新的途徑,使其成為近年來研究生物脫氮的熱點(diǎn).

目前已分離的好氧反硝化菌屬主要有不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)[10-12]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[8,13-15]、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)[5,16];芽孢桿菌屬(Bacillus)[17-20]、叢毛單胞菌屬(Comamonas)[21-23]、副球菌屬(Paracoccus)[24-25]、施氏假單胞菌(P.stutzeri)、微枝桿菌屬(Microvirgula)[26-27]等.但是已分離的好氧反硝化菌多應(yīng)用于污廢水處理、水產(chǎn)養(yǎng)殖和有機(jī)物降解等[28].比如,Bouchez等[27]將Microvirgula aerodenitrificans包埋于藻朊酸鹽中,投加于傳統(tǒng)硝化反應(yīng)器中,用于市政廢水處理,HN-AD脫氮率達(dá)26.8%;Joo等[5]使用Alcaligenes faecalis 處理豬場廢水,總氮去除率高于65%;于愛茸等[29]分離的芽孢桿菌W2具有獨(dú)特的好氧反硝化作用,0.067hm2魚塘投入1Kg的該菌就能完全解決除氮問題;Seung等[16]分離的Alcaligenes sp.P5能在好氧條件下同時(shí)有效的去除苯酚和硝酸鹽.

針對(duì)微污染水體的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的分離鑒定及其脫氮特性的研究很少[30-32].1979年Kuznetsov等[33]提出寡營養(yǎng)細(xì)菌的概念,并定義第一次培養(yǎng)時(shí)能在含碳1～15mg/L培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌稱為寡營養(yǎng)細(xì)菌,能同時(shí)在貧營養(yǎng)和富營養(yǎng)基中生長的稱為兼性寡營養(yǎng)細(xì)菌.Wain Wright等[34]和Button等[35]研究表明,貧營養(yǎng)細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)碳的親和力較大,在低營養(yǎng)環(huán)境中,具有較大的營養(yǎng)競爭優(yōu)勢.由于周村水庫十幾年的網(wǎng)箱養(yǎng)殖的歷史,內(nèi)外源污染造成水庫水體總氮、總磷不同程度的超標(biāo)地表水3類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn).結(jié)合本課題組之前關(guān)于貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的研究[30-32,36],本文通過從微污染水體水庫底層沉積物中富集、馴化、分離出一系列貧營養(yǎng)好氧反硝化菌,并針對(duì)這些貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的系統(tǒng)發(fā)育和脫氮特性進(jìn)行分析,為低氮微污染水體的高度凈化和生物修復(fù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 采集點(diǎn)

從山東某水庫(1#,34°56′38.85″N,117°40′27.42″E; 2#,34°57′9.84″N,117°39′34.17″E;3#,34°57′21.50″N, 117°39′48.67″E; 4#, 34°57′3.03″N, 117°40′4.78″E; 5#,34°57′19.59″N,117°40′51.69″E;6#,34°56′35.16″N, 117°41′04.09″E;7#,34°56′31.41″N,117°41′95.57″E.),采用彼得森采泥器[30]采集表層0 ～ 10cm沉積物,每個(gè)點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),然后裝于滅菌取樣瓶子,放置在裝有冰袋的泡沫箱內(nèi),24h運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,待用.

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[30](g/L): CH3COONa 0.5; NaNO30.1; K2HPO4?3H2O 0.1; CaCl20.05; MgCl2?6H2O 0.05;蒸餾水1000mL;pH 7.0 ～7.5;C/N=8.9/1;TOC=150mg/L;121℃、滅菌30min.

反硝化培養(yǎng)基[30-31](g/L): CH3COONa 0.1; NaNO30.02;K2HPO4?3H2O 0.02; CaCl20.01; MgCl2?6H2O 0.01;蒸餾水1000mL;pH 7.0 ～ 7.5; C/N=8.9/1;TOC=29.26mg/L;121℃、滅菌30min.微量元素(g/L, 2mL/L): EDTA 0.5;ZnSO40.1; MnCl2?4H2O 0.05; FeSO4?7H2O 0.1; CuSO4?5H2O 0.1; CoCl2?6H2O 0.05.

短程反硝化培養(yǎng)基(g/L): CH3COONa 0.1; NaNO20.018;K2HPO4?3H2O 0.02; CaCl20.01; MgCl2?6H2O 0.01;蒸餾水1000mL; pH 7.0 ～7.5;C/N=8.0/1;TOC=29.26mg/L;121℃、滅菌30min.

硝化培養(yǎng)基[30](g/L): CH3COONa 0.5; NH4Cl 0.1;K2HPO4?3H2O 0.1; CaCl20.05; MgCl2?6H2O 0.05;蒸餾水1000mL; pH 7.0 ～ 7.5; 121℃、滅菌30min.

分離培養(yǎng)基[30](g/L): CH3COONa 0.1; NaNO30.02;K2HPO4?3H2O 0.02; CaCl20.01; MgCl2?6H2O 0.01;蒸餾水1000mL;瓊脂,20g;pH 7.0～7.5;C/N=8.9/1;TOC=29.26mg/L;121℃、滅菌30min.

1.3 好氧反硝化菌的富集、馴化、篩選和分離

取一定水庫底泥(約100mL)置于裝有700mL培養(yǎng)基的1L玻璃燒杯,設(shè)置3個(gè)平行系統(tǒng).通過空氣泵間歇曝氣,控制溶解氧在4～6mg/L下培養(yǎng).注入100%滅菌富集培養(yǎng)基,進(jìn)行培養(yǎng);3d后更換培養(yǎng)基為90 %的滅菌富集培養(yǎng)基培養(yǎng);3d后更換培養(yǎng)基為80%的滅菌富集培養(yǎng)基培養(yǎng);3d后更換為70%的滅菌富集培養(yǎng)基培養(yǎng);3d后更換60%的滅菌富集培養(yǎng)基培養(yǎng);3d后更換50 %的滅菌富集培養(yǎng)基培養(yǎng);按照相應(yīng)的比例馴化培養(yǎng),直至達(dá)到10%滅菌富集培養(yǎng)基培養(yǎng).整個(gè)馴化富集階段約為30d[31],馴化結(jié)束后通過吸取培養(yǎng)液1mL放入9mL的滅菌水來進(jìn)行梯度稀釋,稀釋梯度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7.吸取0.2mL各個(gè)稀釋梯度的稀釋液,通過涂布棒在分離培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布,設(shè)置3個(gè)平行.放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱來培養(yǎng).直至長出單菌落,通過在分離培養(yǎng)基平板上劃線來進(jìn)行純化分離.

1.4 好氧反硝化菌株的形態(tài)及生理生化觀察

觀察菌株的菌落特征、個(gè)體形態(tài)以及革蘭氏染色結(jié)果.電鏡觀察:用2.5%戊二醛及餓酸固定液浸泡固定,用緩沖液充分漂洗.然后經(jīng)過梯度濃度的乙醇脫水,臨界點(diǎn)干燥和離子濺射鍍金,在高真空條件下觀察拍照[37].然后根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[38]確定菌株的基本形態(tài).生理生化鑒定依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[39]進(jìn)行.

1.5 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測定

(1)模板DNA的提取:采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)對(duì)分離的好氧反硝化菌進(jìn)行DNA提取.

(2)16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增:以基因組DNA為模板,采用通用引物[30]進(jìn)行擴(kuò)增: 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’.

(3)PCR反應(yīng)體系:10×Ex Taq buffer,2.0μL; 2.5mM dNTP Mix,1.6μL;5p Primer 1,0.8μL;5p Primer 2,0.8μL;Template 0.5μL;5u Ex Taq,0.2μL; ddH2O,14.1μL;共20μL.

(4)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s,55℃復(fù)性30s,72℃延伸90s, 24個(gè)循環(huán);72℃,10min.

(5)經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出16S rDNA,采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的DNA快速回收試劑盒將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,以備測序.

1.6 16S rRNA的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rRNA基因的測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成.測定序列與GenBank上已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST分析,選取數(shù)據(jù)庫中同源性相近的模式菌株,用于系統(tǒng)發(fā)育分析;同時(shí)將分離的好氧反硝化菌與已知的模式菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析.用MEGA version 5軟件包中的Kinura2-Parameter Distance 模型計(jì)算進(jìn)化距離,用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,1000次隨機(jī)抽樣,計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以估計(jì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的置信度[3].

1.7 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的脫氮特性

將分離的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌從平板上用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有50mL滅菌反硝化液體培養(yǎng)基的150mL的錐形瓶中,在30℃、120r/min培養(yǎng)24h進(jìn)行活化.然后將活化后的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌以體積比1%接種到反硝化培養(yǎng)基(有微量元素的和無微量元素的)、短程反硝化培養(yǎng)基、改良型硝化培養(yǎng)基和滅菌源水中來考察貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的脫氮特性.

1.8 分析方法

菌密度在510nm波長下(DR6000,哈希)的吸光度測定;水質(zhì)指標(biāo)采用分光光度法[40]測定.硝氮為紫外-分光光度法;亞硝氮采用萘乙二胺分光光度法;氨氮采用納氏試劑分光光度法;TN (總氮)和TDN(溶解性總氮)為堿式過硫酸鉀消解紫外分光光度法;總磷采用鉬酸銨分光光度法;TOC 由TOC分析儀(ET1020A)測定;pH和DO由HQ11d和HQ30d測定;水樣經(jīng)0.45μm 醋酸纖維濾膜過濾.

2 結(jié)果與討論

2.1 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌株的分離及特征

通過對(duì)馴化后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋,并對(duì)單菌落進(jìn)行多次劃線分離純化得到196株貧營養(yǎng)好氧反硝化菌株.通過初篩后得到14株高效好氧反硝化菌株命名為:ZHF2、ZHF3、ZHF5、ZHF6、ZHF8、ZMF2、ZMF5、ZMF6、N299、G107、81Y、SF9、SF18和SXF14.將這14株貧營養(yǎng)好氧反硝化菌株通過平板劃線培養(yǎng)2d后,觀察好養(yǎng)反硝化細(xì)菌菌落情況;進(jìn)行革蘭氏染色;電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察.貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的菌落形態(tài)以及菌株生理生化特征如表1所示.

表1 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的形態(tài)及生理生化特征Table 1 The morphology and physiology-biochemical characteristics of oligotrophic aerobic denitrifiers

表2 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的測序結(jié)果Table 2 The sequences information of oligotrophic aerobic denitrifiers

圖1 基于16S rRNA 序列建立的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌和其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the comparison of partial 16S rRNA gene sequences of oligotrophic aerobic denitrifiers and other culture strains sequences

2.2 16S rRNA基因測序與分析

通過對(duì)貧營養(yǎng)好氧反硝化菌進(jìn)行擴(kuò)增后測序,得到14株貧營養(yǎng)的序列長度.其中16S rRNA基因序列與相應(yīng)種屬的模式菌株的信息由表2可知.將分離的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌與相應(yīng)的模式菌株的16S rRNA通過MEGA version 5 用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果如圖1所示.ZHF3、ZHF5、ZHF6、ZMF2、G107、81Y、SF18和SXF14與不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)接近,ZHF2和ZHF8與新鞘脂菌屬(Novosphingobium sp.)最為接近,ZMF5與水桿菌屬(Aquabacterium sp.)最為接近,ZMF6與鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas sp.)最為接近,N299與動(dòng)膠桿菌屬(Zoogloea sp.)最為接近,SF9與代爾夫特菌屬(Delftia sp.)最為接近.并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征,可初步確定貧營養(yǎng)菌株ZHF3、ZHF5、ZHF6、ZMF2、G107、81Y、SF18 和SXF14為不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.),ZHF2和ZHF8為新鞘脂菌屬(Novosphingobium sp.), ZMF5為水桿菌屬(Aquabacterium sp.),ZMF6為鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas sp.),N299為動(dòng)膠桿菌屬(Zoogloea sp.),SF9為代爾夫特菌屬(Delftia sp.).

2.3 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的脫氮特性

圖2 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的反硝化特性(含微量元素)Fig.2 Denitrification performances of oligotrophic aerobic denitrifiers in nitrate medium (with TE solution)

2.3.1 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的反硝化特性 將分離的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌從平板上用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有50mL滅菌反硝化液體培養(yǎng)基的150mL的錐形瓶中,在30℃、120r/min培養(yǎng)24h進(jìn)行活化.然后將活化后的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌以體積比1%接種到含有微量元素的反硝化培養(yǎng)基,在30℃、120r/min培養(yǎng)72h.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測定硝氮濃度,反映菌株脫氮效果.如圖2所示,分離的14株貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的硝氮去除率達(dá)到60%以上,其中G107,81Y效果最好,72h能將硝氮從3.56mg/L下降到0.04和0.02mg/L;硝氮去除率達(dá)到98.88%和99.44%.以G107和81Y為代表研究反硝化過程,將G107和81Y活化后以體積比1%轉(zhuǎn)接入不含微量元素的反硝化培養(yǎng)基,定期取樣研究氮的轉(zhuǎn)化過程.從圖3可以看到G107 和81Y從初始硝氮(3.54 ± 0.03)mg/L 72h下降到(0.41±0.02)mg/L和(0.52±0.07)mg/L, G107在0～24h的脫氮效率最高,81Y在24～72h的脫氮效率最高,與兩株菌所處的對(duì)數(shù)生長期相吻合,相比于加有微量元素的反硝化培養(yǎng)基去除率有所降低,說明微量元素的添加有利于提高反硝化菌的脫氮能力;亞硝氮僅為(0.08±0.01)mg/L和(0.08±0.01)mg/L,沒有出現(xiàn)積累;總氮從(3.63± 0.03)mg/L下降到(2.18±0.05)mg/L和(2.41±0.06) mg/L,說明(39.90±1.45)%和(33.72±1.78)%的氮轉(zhuǎn)化為氣體去除;TDN從(3.63±0.03)mg/L下降到(1.63±0.09)和(1.72±0.07)mg/L,與TN相比得出～0.55mg/L和0.69mg/L轉(zhuǎn)化為細(xì)胞體氮.G107和81Y兩個(gè)系統(tǒng)的TOC從(28.38±0.69)mg/L,下降到2.48mg/L和2.00mg/L, 碳源的不足影響反硝化過程的進(jìn)行.已有研究報(bào)道:全向春等[41]分離2株好氧反硝化菌對(duì)模擬廢水處理的脫氮率為82%;郝兵兵等[42]從養(yǎng)殖廢水中馴化分離的好氧反硝化Pseudomonas sp.F28的反硝化率在70%;周娜等[31]分離的ZN1和ZN2硝氮去除率80%;徐向陽等[43]在同水平下的培養(yǎng)基(TOC 48mg/L,硝氮4mg/L),添加好氧反硝化菌P.mendocina 3-7,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)硝氮和總氮的去除率達(dá)到31.7%和45.0%.相比之下,本實(shí)驗(yàn)分離的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的脫氮效果更明顯.接下來以高效好氧反硝化菌G107和81Y為代表研究以亞硝氮、氨氮為氮源以及在微污染水源水條件的脫氮情況.

圖3 好氧反硝化菌G107和81Y的反硝化脫氮特性 (不含微量元素)Fig.3 Denitrification performances of strains G107 and 81Y in nitrate medium (without TE solution)

2.3.2 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的短程反硝化脫氮特性 由于水體過多的亞硝酸鹽會(huì)引起水生動(dòng)物血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白,影響生物體的氧氣運(yùn)輸,造成多種生理紊亂現(xiàn)象[44].基于魚蝦等水生動(dòng)物的安全,一般將亞硝酸鹽氮含量控制在0.1mg/L以內(nèi)[45],所以研究分離的高效貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的短程反硝化特性十分必要,考慮入庫河流和庫區(qū)亞硝酸鹽的最大濃度,確定培養(yǎng)基亞硝氮濃度為3～4mg/L.將高效菌株(G107, 81Y)活化后以體積比1%接種到短程反硝化培養(yǎng)基,圖4A和4C展示菌株在初始亞硝態(tài)氮為3.76mg/L短程反硝化培養(yǎng)基中的脫氮效果.G107 和81Y在對(duì)數(shù)生長期出現(xiàn)最大的脫氮過程,從初始(3.76±0.08)mg/L到120h時(shí)下降到(1.25± 0.05) mg/L和(1.60±0.12)mg/L,與此同時(shí)TOC從(27.70±0.75)mg/L下降到(4.95±0.17)mg/L和(0.16±0.14)mg/L;在120h亞硝氮去除率達(dá)到65.59%,59.51%;與此同時(shí),4B和4D中展示,TN和TP分別有(48.98±12.91)%,(45.37±4.66)%和(12.91±0.98)%,(17.42±3.76)%的去除,試驗(yàn)期間并沒有出現(xiàn)硝氮的積累.很少有好氧反硝化菌以亞硝氮為氮源進(jìn)行反硝化[46],相比于Pseudomonas sp.yy7[46]在初始亞硝氮5mg/L條件下,8h完全去除;P.putida Y-9[45]在初始亞硝酸鹽氮為10mg/L條件下亞硝氮去除率達(dá)到100%;本實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)出良好的短程反硝化特性.

圖4 好氧反硝化菌G107和81Y的短程反硝化脫氮特性Fig.4 Nitrogen removal performances of strains G107 and 81Y in nitrite medium

2.3.3 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的硝化特性 因大多數(shù)好氧反硝化菌具有異養(yǎng)硝化特性,考慮到天然水庫水體中另一主要無機(jī)氮-氨氮的存在,所以對(duì)已分離的高效貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的硝化特性潛力的研究很有必要.將高效菌株(G107和81Y)活化后以體積比1 % 接種到硝化培養(yǎng)基.圖5A和5C展示菌株在硝化培養(yǎng)基條件下的硝化特性,G107和81Y從初始氨氮(28.27±0.14)mg/L下降到(18.57±0.99)mg/L和(18.41±2.08)mg/L,去除率達(dá)到34.31%和34.32%;圖5B和5D顯示,TN的去除率達(dá)到36.75%和26.85%(轉(zhuǎn)化為氣體的氮素);硝氮和亞硝氮沒有出現(xiàn)積累,僅為0.15, 0.27和0.01,0.01mg/L;TOC也隨著脫氮的進(jìn)行下降了83.56%和83.48%;同時(shí)隨著反硝化菌的生長,TP也有5.99 %和6.38%的去除;相比于P.stutzeri C3[47]不能利用氨氮進(jìn)行異養(yǎng)硝化; Rhodococcus sp.CPZ24[48]的氨氮去除率為100%; Rhizobium sp.PY8[49]在相同的培養(yǎng)基中16d,氨氮去除率達(dá)到58.17%.72h實(shí)驗(yàn)結(jié)束后氨氮去除率達(dá)到44.12%,34.31%,34.87%,35.66%,和 65.63%,雖然已分離的好氧反硝化菌不是高效的硝化菌,但是仍然具有不錯(cuò)的硝化特性.今后將針對(duì)接近源水水質(zhì)的低氨氮濃度的脫氮過程進(jìn)行相應(yīng)的研究.

2.3.4 貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的源水脫氮特性 為了研究在貧營養(yǎng)水體環(huán)境中,已分離的高效貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的脫氮特性.將高效菌株(G107和81Y)活化后以體積比1%接種到滅菌源水培養(yǎng)基中來考察貧營養(yǎng)好氧反硝化菌的脫氮效果.圖6為初始總氮(2.69±0.03)mg/L的滅菌源水培養(yǎng)基條件下的脫氮效果,G107與81Y的總氮下降到(1.33±0.10)mg/L和(1.56±0.31)mg/L,約有50.56%和42.01%的氮以氣體形式得到去除;與此同時(shí)兩系統(tǒng)的TOC從初始的(3.06±0.05) mg/L下降到 (1.21±0.04)mg/L和(1.70±0.11) mg/L;隨著脫氮的進(jìn)行,兩系統(tǒng)的TDN和DO也有相同的下降趨勢,TDN從初始(2.60±0.05)下降到(1.04±0.10)mg/L和(1.17±0.10)mg/L,相比于TN濃度得出～0.1mg/L和～0.4mg/L的氮為生物體氮的形式存在;DO從(8.53±0.03)mg/L下降到(7.32±0.04)mg/L和(7.32±0.03)mg/L;pH值略有上升,基本保持恒定.C/N(TOC/TN)從初始的1.14/1到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)0.91/1和1.09/1,始終維持在低碳氮比的環(huán)境下.相比于P.stutzeri T1[50]在投加檸檬酸鹽為碳源的源水中(C/N=4)硝氮和氨氮幾乎沒有變化;P.mendocina 3-7[43]在過濾的源水水體中的總氮去除率達(dá)到85%;巍巍等[51]應(yīng)用低溫貧營養(yǎng)脫氮功能菌群P1(Y8+W3+W4)進(jìn)行微污染水源水體修復(fù),36d硝氮和總氮去除率達(dá)到46%和53%;黃延林等[31]分離的菌株ZN1,ZN2,ZN3在源水環(huán)境下,總氮去除率20～25%;張麗娜等[52]分離的Acinetobacter pittii A14接種到微污染源水中總氮去除率達(dá)到50.95%;與本實(shí)驗(yàn)72h總氮去除率50.56%和42.01%相一致.顯示了對(duì)微污染水源水體很強(qiáng)的適應(yīng)性和很好的貧營養(yǎng)環(huán)境下的脫氮能力.

圖5 好氧反硝化菌G107和81Y的硝化脫氮特性Fig.5 Nitrogen removal performances of strains G107 and 81Y in ammonia medium

圖6 好氧反硝化菌G107和81Y的源水脫氮特性Fig.6 Nitrogen removal performances of strains G107 and 81Y in source water medium

3 結(jié)論

3.1 采用改良的富集馴化方法,篩選分離出貧營養(yǎng)好氧反硝化菌.經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列分析,確定不動(dòng)桿菌屬,新鞘脂菌屬,水桿菌屬,鞘脂單胞菌屬,動(dòng)膠桿菌屬,代爾夫特菌屬共6個(gè)種屬.結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析,該分離的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌豐富了已有的好氧反硝化菌的種類.

3.2 通過對(duì)以優(yōu)勢菌G107,81Y為代表的一系列脫氮特性實(shí)驗(yàn)得出,添加微量元素的有利于脫氮的進(jìn)行,硝氮去除率達(dá)到98.88%和99.44%,不加微量元素的反硝化速率達(dá)到88.42%和85.31%;與此同時(shí),G107和81Y不僅能利用亞硝氮、氨氮為氮源實(shí)現(xiàn)脫氮,而且在貧營養(yǎng)源水條件下?lián)碛?0.56%和42.01%的脫氮率,展現(xiàn)出貧營養(yǎng)好氧反硝化菌對(duì)寡營養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性,為低氮微污染水源水的生物修復(fù)提供技術(shù)支撐.

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Isolation, Identification, and nitrogen removal characteristics of oligotrophic aerobic denitrifiers.

ZHOU Shi-lei, HUANG Ting-lin*, BAI Shi-yuan, HE Xiu-xiu (Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Ministry of Education, School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China).China Environmental Science, 2016,36(1)：238～248

Abstract：In order to isolate the aerobic denitrifiers from oligotrophic reservoir system, and study the taxonomic status and nitrogen removal characteristics for providing evidence to remediate the micro-polluted source water.The oligotrophic aerobic denitrifiers were obtained, through enrichment, domestication, and screening processes, and taxonomic statuses were determined by 16S rRNA, and the nitrogen removal characteristics was detected in the pure culture and source water experiment.As a result, 196 strains were isolated, and 14 strains (ZHF2, ZHF3, ZHF5, ZHF6, ZHF8, ZMF2, ZMF5, ZMF6, N299, G107, 81Y, SF9, SF18, and SXF14) demonstrated the perfect nitrogen removal performances.Based on morphological, physiological, and phylogenetic analysis, ZHF3, ZHF5, ZHF6, ZMF2, G107, 81Y, SF18, and SXF14 were identified as Acinetobacter sp.; ZHF2, and ZHF8 were identified as Novosphingobium sp.; ZMF5 was identified as Aquabacterium sp.; ZMF6 was identified as Sphingomonas sp.; N299 was identified as Zoogloea sp.; SF9 was identified as Delftia sp..The nitrate removal rates of G107 and 81Y reached 98.88 % and 99.44%, in 72h.Meanwhile, the oligotrophic aerobic denitrification bacteria G107 and 81Y demonstrated the obvious nitrogen removal performances in nitrite medium, ammonia medium and source water medium.From all the results, the isolations of oligotrophic aerobic denitrifiers enriched the species of aerobic denitrification bacteria, and the perfect nitrogen removal performances provided a significant parameter to remediate the micro-polluted reservoir water system.

Key words：oligotrophic；aerobic denitrification；identification；phylogenetic analysis；nitrogen removal characteristic

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)01-0238-11

收稿日期：2015-05-07

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃(2012BAC04B02)

作者簡介：周石磊(1987-),男,河北石家莊人,西安建筑科技大學(xué)博士研究生,主要從事水環(huán)境修復(fù)與水源水質(zhì)微污染控制的相關(guān)研究.