吳敬，林佳，張艷艷，裴娜，張雪梅

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000）

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CASP1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與生物學(xué)意義*

吳敬，林佳，張艷艷，裴娜，張雪梅

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000）

摘要：目的探討含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase-1（CASP1）表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法收集華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院2010～2014年確診為NSCLC患者的肺癌及癌旁組織25對(duì)。采用免疫組織化學(xué)染色方法，比較CASP1基因在肺癌和癌旁組織以及不同病理類型及分化程度肺癌組織中的表達(dá)差異。使用正常和腫瘤組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GENT）提供的數(shù)據(jù)，分析CASP1在肺癌組織及正常組織中的表達(dá)差異。結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CASP1在肺癌組織中的表達(dá)量（0.021±0.004）低于相應(yīng)的癌旁組織（0.083±0.008），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-8.554，P=0.000）。進(jìn)一步對(duì)GENT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在U133plus2提供的數(shù)據(jù)中，CASP1在肺正常組織中的表達(dá)量為（1137±42.17），高于其在肺腫瘤組織中的表達(dá)量（844± 19.35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-7.037，P=0.000）。同樣的結(jié)果出現(xiàn)在U113A提供的數(shù)據(jù)中，CASP1在肺正常組織的表達(dá)（467±11.19）高于其在肺腫瘤組織（423±8.44）中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.898，P=0.004）。不同分化程度肺癌組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CASP1的表達(dá)水平在高分化（0.027±0.006）、中分化（0.017±0.003）、低分化（0.007±0.002）肺癌組織中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.653，P=0.006）。組間比較顯示，CASP1在高分化組織中的表達(dá)高于其在低分化肺癌組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），但與中分化組織中的表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.056）。筆者未發(fā)現(xiàn)CASP1在肺腺癌（0.019±0.003）和鱗癌（0.012± 0.004）中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.382，P=0.180）。結(jié)論CASP1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，表明其在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：Caspase-1；非小細(xì)胞肺癌；免疫組織化學(xué)；細(xì)胞凋亡

肺癌是嚴(yán)重影響人類生存質(zhì)量的重大疾病之一。在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，位于全部腫瘤死因的首位［1］。肺癌分非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩種。其中NSCLC約占全部肺癌發(fā)病的85%，而且70%～80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，5年生存率極低。

Caspase（cysteinyl aspartate-specific proteases，CASP）是一組半胱氨酸天冬氨酸特異的蛋白水解酶。Caspase-1（cysteinyl aspartate-specific proteases-1，CASP1）作為最早發(fā)現(xiàn)的CASP家族成員之一，不僅參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，還與細(xì)胞凋亡過(guò)程有著密不可分的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，CASP1與多種疾病有關(guān)，例如：CASP1作為炎癥趨化因子在2型糖尿病發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，可能成為治療2型糖尿病的作用靶點(diǎn)［2］；CASP1在多種腫瘤細(xì)胞中（如結(jié)腸癌、前列腺癌和肝癌）表達(dá)降低［3-5］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。本研究擬通過(guò)比較肺癌與癌旁組織中CASP1的表達(dá)差異，探討CASP1在肺癌發(fā)病過(guò)程中的作用。

1　資料與方法

1.1標(biāo)本收集

研究標(biāo)本選取自華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院2010～2014年期間病理存檔的石蠟標(biāo)本，非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本和距腫瘤邊緣≥5 cm的癌旁組織各25例。非小細(xì)胞肺癌組中，男性13例，女性12例，年齡37～70歲，平均年齡57.1歲。經(jīng)病理學(xué)診斷，9例鱗癌和16例腺癌。低分化7例，中分化10例，高分化8例。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。

1.2主要試劑

兔抗人CASP1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G和免疫組織化學(xué)二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

石蠟標(biāo)本制成4μm厚的切片，免疫組織化學(xué)程序按照DAB顯色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照，以磷酸緩沖鹽溶液代替一抗。組織病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，滴加3%過(guò)氧化氫H2O2進(jìn)行高壓抗原修復(fù)；加入CASP1一抗（1∶80稀釋），4℃過(guò)夜孵育；37℃復(fù)溫后，加二抗37℃孵育1 h后，DAB顯色。經(jīng)蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明和中性樹(shù)膠封片后，使用Olympus BX53型顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.4結(jié)果判定

于每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野（×400），用Image-Pro Plus 7.0分析軟件計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的平均積分光密度（累積積分光密度/面積），平均光密度值表示免疫組織化學(xué)強(qiáng)度，反映CASP1在組織中的表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用正常和腫瘤組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression database of normal and tumor tissues，GENT），分析Affymetrix U133A和U133plus2兩個(gè)平臺(tái)提供的CASP1表達(dá)數(shù)據(jù)［6］。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，使用配對(duì)t檢驗(yàn)比較CASP1在肺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異；使用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組樣本之間的分析；使用方差分析進(jìn)行多組樣本間的統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。GENT表達(dá)數(shù)據(jù)分析采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U檢驗(yàn)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CASP1在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CASP1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色和棕褐色的顆粒樣物質(zhì)，見(jiàn)圖1。CASP1在肺癌組織中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量為（0.021±0.004）。CASP1在肺癌旁組織中的表達(dá)量為（0.083±0.008），高于其在肺癌組織中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-8.554，P=0.000）。

筆者隨后對(duì)GENT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在U133plus2提供的數(shù)據(jù)中，CASP1在肺正常組織中的表達(dá)量為（1 137±42.17），高于其在肺腫瘤組織中的表達(dá)量（844±19.35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z= -7.037，P=0.000）。同樣的結(jié)果出現(xiàn)在U113A提供的數(shù)據(jù)中，CASP1在肺正常組織的表達(dá)量（467± 11.19），高于其在肺腫瘤組織（423±8.44）中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.898，P=0.004）。

2.2CASP1表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系

通過(guò)對(duì)不同分化程度肺癌組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CASP1的表達(dá)水平在高分化（0.027±0.006）、中分化（0.017±0.003）、低分化（0.007±0.002）肺癌組織中的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.653，P=0.006）。組間比較顯示，CASP1在高分化組織中的表達(dá)高于其在低分化肺癌組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），但與中分化組織中的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.056），見(jiàn)圖2。對(duì)不同病理類型肺癌組織中的CASP1表達(dá)水平進(jìn)行分析，筆者發(fā)現(xiàn)在肺腺癌和鱗癌組織中CASP1的表達(dá)水平分別為（0.019±0.003）和（0.012±0.004），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.382，P=0.180）。

3　討論

圖1　CASP1在NSCLC患者肺組織中的表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)定位于胞漿（×400）

圖2　CASP1在不同病理分級(jí)NSCLC組織中的表達(dá)（×400）

CASP1定位于11q22，屬于炎癥型半胱氨酸蛋白水解酶家族成員，經(jīng)活化后可激活I(lǐng)L-1β和IL-18等一系列炎癥因子，在炎癥反應(yīng)中起核心調(diào)控作用［7-9］。此外，CASP1還參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。在神經(jīng)元細(xì)胞中，CASP1通過(guò)激活Caspase-6而引發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CASP1在成纖維細(xì)胞Rat-1中的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，而且該過(guò)程可被CASP1抑制劑所逆轉(zhuǎn)［11］。在CASP1敲除的嗜中性粒細(xì)胞也出現(xiàn)自發(fā)性細(xì)胞凋亡延遲的現(xiàn)象［12］。CASP1參與的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡能有效提高機(jī)體抵抗外源性和內(nèi)源性破壞的能力，達(dá)到保護(hù)宿主的目的［13］。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，CASP1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)降低可能和CASP1在細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中的重要作用有關(guān)。與筆者研究結(jié)果類似，一項(xiàng)卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)，CASP1在癌細(xì)胞中表達(dá)下降，而且過(guò)表達(dá)CASP1可引起癌細(xì)胞凋亡［14］。CASP1表達(dá)水平的下降也見(jiàn)于結(jié)腸癌和淋巴瘤細(xì)胞中［5，15］。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)，CASP1在肺癌不同分化程度組織中表達(dá)量有顯著差異。高分化肺癌組織中CASP1表達(dá)量顯著高于低分化程度肺癌，提示CASP1下調(diào)與肺癌的惡化程度有關(guān)。

通常情況下CASP1以無(wú)活性的酶原存在于細(xì)胞中。CASP1的活性復(fù)合物叫做“炎癥小體”，由NLRP1、Caspase-5相互作用，并通過(guò)ASC分子與CASP1作用形成的高分子量蛋白復(fù)合體［16］。在某些創(chuàng)傷刺激或急性炎癥下，各種免疫細(xì)胞被募集到癥灶，分泌大量的細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素IL-1β和IL-18），構(gòu)成炎癥微環(huán)境，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。但如果靶器官受到長(zhǎng)期低強(qiáng)度刺激，會(huì)導(dǎo)致某些細(xì)胞原癌基因激活，使正常細(xì)胞開(kāi)始向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化［17］，增加腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［18-19］。目前認(rèn)為，CASP1對(duì)腫瘤的調(diào)控作用在兩個(gè)方面［20］。一方面，CASP1介導(dǎo)IL-1β的釋放通過(guò)調(diào)控外周組織和腫瘤微環(huán)境中髓源性抑制細(xì)胞的發(fā)育，從而對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到關(guān)鍵的調(diào)控作用［21］。另一方面，CASP1通過(guò)激活機(jī)體的獲得性免疫或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。以無(wú)活性酶原形式存在于細(xì)胞中的CASP1，被大分子ASC二聚體激活［22］，進(jìn)一步催化caspase-7和其他作用底物的蛋白水解活性［23］，引發(fā)細(xì)胞凋亡［24］。在腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌模型中，激活的CASP1介導(dǎo)IL-18的釋放，有效保護(hù)上皮細(xì)胞的完整，可以防止腸炎和結(jié)腸癌的發(fā)生［25-26］。腫瘤細(xì)胞釋放危險(xiǎn)信號(hào)，激活NLRP3炎癥小體和釋放IL-1β，誘發(fā)IL-1β依賴性的獲得性免疫，抑制腫瘤的生長(zhǎng)［27］。這些表明CASP1發(fā)揮著重要的抗腫瘤作用。

正常情況下機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞損傷-修復(fù)和增殖-凋亡處于動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，當(dāng)平衡一旦被破壞就可能導(dǎo)致機(jī)體正常組織發(fā)生損傷，從而引起腫瘤的發(fā)生。筆者的研究證實(shí)CASP1在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)在肺癌發(fā)生中的重要作用提供了理論基礎(chǔ)。

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（張蕾編輯）

論著

Significance of CASP1 protein expression in non-small cell lung cancer*

Jing Wu，Jia Lin，Yan-yan Zhang，Na Pei，Xue-mei Zhang
（College of Life Science，North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China）

Abstract：Objective To explore the role of caspase-1（CASP1）in the development of non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Lung tumor and adjacent normal samples from 25 NSCLC patients were collected at the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology from 2010 to 2014. CASP1 protein expression was analyzed by immunohistochemistry. Gene expression database of normal and tumor tissues（GENT）was used to analyze the difference of CASP1 expression between lung cancer and normal lung tissues. Results Immunohistochemistry analysis revealed that CASP1 protein expression in the lung tumor tissues（0.021±0.004）was lower than that in the adjacent tissues［（0.083±0.008），t = -8.554，P = 0.000］. Analysis of the CASP1 data from GENT revealed thatbook=41,ebook=46CASP1 expression in the lung cancer tissues was significantly lower than that in the normal tissues in both U133plus2（Z = -7.037，P = 0.000）and U133A platforms（Z = -2.898，P = 0.004）. The protein expression of CASP1 in the well-differentiated lung cancer（0.027±0.006）was higher than that in the poorly-differentiated lung cancer［（0.007±0.002），P =0.001］，but not significantly different from that in the moderately-differentiated lung cancer［（0.017±0.003），P = 0.056］. There was no significant difference in the CASP1 expression between the lung adenocarcinoma（0.019±0.003）and squamous cell carcinoma［（0.012±0.004），t = 1.382，P = 0.180］. Conclusions CASP1 expression is down-regulated in non-small cell lung cancer tissues，which indicates that CASP1 protein expression may contribute to the development of NSCLC.

Keywords：caspase-1；non-small cell lung cancer；immunohistochemistry；apoptosis

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.009

文章編號(hào)：1005-8982（2016）10-0040-05

收稿日期：2015-11-17

*基金項(xiàng)目：河北省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)領(lǐng)軍人才培育計(jì)劃（No：LJRC001）

［通信作者］張雪梅，E-mail：jyxuemei@aliyun.com