李遼，王金，尚培中

（1.河北北方學院，河北張家口075000；2.解放軍第二五一醫(yī)院普通外科，河北張家口075000）

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膜聯(lián)蛋白A1和CA19-9在膽管癌中的表達及其臨床意義

李遼1，王金2，尚培中2

（1.河北北方學院，河北張家口075000；2.解放軍第二五一醫(yī)院普通外科，河北張家口075000）

摘要：目的觀察膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1）和腫瘤特異性大分子糖蛋白抗原CA19-9在膽管癌中的表達，探討兩者與膽管癌臨床病理特征之間的關系。方法采用免疫組織化學檢測54例膽管癌術后標本（癌組織和癌旁組織）及15例非腫瘤膽管組織中Annexin A1和CA19-9的表達，分析兩者與臨床病理特征的關系。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分別檢測24例健康志愿者、24例膽管結石患者、24例膽管癌患者血清中Annexin A1和CA19-9的表達情況。結果膽管癌組織中Annexin A1和CA19-9表達的陽性率顯著高于癌旁組織和非腫瘤膽管組織（P＜0.05）。Annexin A1的表達狀態(tài)與膽管癌的臨床病理分期、組織學分級及淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與患者發(fā)病年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05）；CA19-9的表達與膽管癌的淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與患者發(fā)病年齡、腫瘤大小、臨床病理分期及組織學分級無關（P＞0.05）。Annexin A1和CA19-9在膽管癌組織中的表達呈正相關（r=0.356，P＜0.05）。ELISA結果表明，膽管癌患者組血清中Annexin A1和CA19-9表達含量高于膽管結石患者組及健康人組（P＜0.05）。Annexin A1和CA19-9在膽管癌術前與術后血清中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論Annexin A1和CA19-9與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結轉移有關，聯(lián)合檢測可為膽管癌診斷及預后判斷提供一定的參考價值。

關鍵詞：膽管癌；Annexin A1；CA19-9

膽管癌是一種起源于肝內(nèi)或肝外膽管上皮的惡性腫瘤，其發(fā)生率約占消化道腫瘤的3%，近年來全球發(fā)病率及死亡率均有所上升［1-2］。隨著影像技術的發(fā)展，臨床上對膽管癌的診斷取得長足進步，但是在新的腫瘤標志物研究方面仍是進展緩慢。從分子生物學角度尋求更好、更精確的指標是目前研究的熱點。Annexin A1是膜聯(lián)蛋白家族中的一員，具有鈣依賴性磷脂結合功能，參與炎癥反應、細胞周期調(diào)控、增殖、分化和凋亡等多種生物學行為［3］。近來研究表明，Annexin A1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后相關。CA19-9是一種含黏液成分的腫瘤特異性大分子糖蛋白抗原（carbohydrate antigen，CA），在膽胰惡性腫瘤的診斷中具有較高的敏感性和特異性，對于腫瘤的轉歸、復發(fā)和預后是一個有價值的指標［4］。本研究采用免疫組織化學和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）聯(lián)合檢測Annexin A1和CA19-9在膽管癌中的表達，探討Annexin A1和CA19-9與膽管的關系。

1　資料與方法

1.1組織標本

選取2010年2月-2014年1月解放軍第二五一醫(yī)院54例膽管癌手術切除后的蠟塊標本為膽管癌組織。其中，男性34例，女性20例，男女比例1.7∶1，年齡43～82歲，平均年齡（60.370±1.249）歲。臨床及病理資料齊全，術前均未接受放療、化療及其他針對腫瘤的治療，術后病理組織學診斷均為腺癌。按世界衛(wèi)生組織分類標準進行組織學分級［5］：高分化22例、中分化24例、低分化8例。臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會TNM分期2010版［6］進行，其中Ⅰ期9例、Ⅱ期16例、Ⅲ期12例、Ⅳ期17例。選取距離腫瘤邊緣≥1 cm經(jīng)病理證實為不典型增生組織為癌旁組織。同時取15例為非腫瘤膽管組織。膽管損傷、膽管囊腫患者的膽管組織標本。

1.2血清標本

收集2014年8月-2015年4月間在解放軍第二五一醫(yī)院就診的膽管癌患者24例為膽管癌組，選取同期在該院就診膽管結石患者24例為膽管結石組，另外收集24例在該院體檢中心經(jīng)化驗各項指標均正常體檢者血清為健康組。所有患者在血清標本采集前均未行放療及化療，所有病例資料完整。

1.3試劑

鼠抗人Annexin A1免疫組織化學單克隆抗體（濃縮型），Annexin A1酶聯(lián)免疫分析試劑盒，鼠抗人CA19-9免疫組織化學單克隆抗體（即用型），CA19-9酶聯(lián)免疫分析試劑盒均系美國Cloud-Clone Corp公司；EliVisionTMplus二步法免疫組織化學染色試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液均系福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1免疫組織化學EliVisionTMplus二步法所有組織標本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，免疫組織化學染色步驟按試劑盒說明書進行操作，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照組，以公司提供的陽性切片作陽性對照組。

1.4.2酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）抽取患者初診治療前1天晨起空腹靜脈血5 ml，3 500 r/min離心15 min，提取上層血清，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，再于患者手術后第10天抽取晨起空腹靜脈血5 ml，按上述方法保存。標本成批檢測，血清無溶血、脂濁。所有操作嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.5結果判定

免疫組織化學染色結果通過雙盲法評價，確定染色結果。Annexin A1以細胞漿或細胞膜或兩者同時出現(xiàn)棕黃色沉著為陽性信號；CA19-9以細胞漿或細胞膜上出現(xiàn)棕黃色沉著為陽性表達，根據(jù)陽性細胞顯色強度和百分數(shù)進行分析，依據(jù)陽性細胞顯色程度計分：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據(jù)顯色細胞陽性百分比計分：高倍視野下每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，計算陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總計數(shù)百分比，無或陽性細胞＜10%記為0分，10%～25%記為1分，25%～50%記為2分，＞75%記為3分。將兩個分值相加，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為陽性（++），5分以上為強陽性（+++）。

ELISA試驗使用北京普朗公司生產(chǎn)的DNM-9602標準規(guī)格酶標儀檢測，以標準物濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，選擇擬合系數(shù)（即“r”值）最好的曲線方程對測得數(shù)據(jù)進行分析。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，ELISA試驗中多組計量資料用方差分析，術前與術后比較用配對t檢驗，免疫組織化學中Annexin A1和CA19-9的表達及其與膽管癌臨床病理特征分析用X2檢驗，Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1Annexin A1和CA19-9在膽管癌不同組織中的表達

在膽管癌、膽管癌旁和非腫瘤膽管3種不同組織中，Annexin A1的陽性表達率分別為70.37%（38/ 54），33.33%（18/54），6.67%（1/15），各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（X2=25.709，P＜0.05）；CA19-9的陽性表達率分別為74.07%（40/54），38.89%（21/54），13.33%（2/15），各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（X2= 23.192，P＜0.05）。見圖1、2和表1。

圖1　Annexin A1在膽管組織中的表達（EliVisionTMplus×100）

圖2　CA19-9在膽管組織中的表達（EliVisionTMplus×100）

2.2Annexin A1和CA19-9的表達水平與膽管癌患者臨床病理特征關系

54例膽管癌患者中，Annexin A1的表達與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05）；CA19-9的表達則與淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤的分化程度、TNM分期無關（P＞0.05）。見表2。

2.3膽管癌中Annexin A1和CA19-9表達之間的關系

38例Annexin A1陽性表達的膽管癌組織中，同時有CA19-9陽性表達32例，共陽率為59.26%，在16例Annexin A1陰性表達的標本中，同時有CA19-9陰性表達8例，共陰率為14.81%。經(jīng)Spearman相關分析，Annexin A1和CA19-9在膽管癌中的表達呈正相關，兩者相關系數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（r=0.356，P=0.008＜0.05）。見表3。

2.43組血清標本中AnnexinA1和CA19-9的含量

膽管癌組血清Annexin A1、CA19-9表達水平明顯高于膽管結石組及健康組，差異有統(tǒng)計學意義（Annexin A1：F =68.525，P =0.000；CA19-9：F =135.333，P=0.000）；在膽管結石組血清中Annexin A1的表達水平略高于健康組，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P=0.660）；CA19-9在膽管結石患者血清中的表達水平高于健康組，但兩者差異也無統(tǒng)計學意義（P=0.731）。見表4。

2.5膽管癌組手術前后血清中Annexin A1和CA19-9的含量

膽管癌組患者手術前血清中Annexin A1和CA19-9的含量均高于手術后，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表1　Annexin A1和CA19-9在不同膽管組織中的表達　例（%）

表2　膽管癌組織中Annexin A1、CA19-9表達與臨床病理特征的關系　例（%）

表3　Annexin A1和CA19-9在膽管癌中表達的關系　例

表4　3組血清中Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

表4　3組血清中Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

組別　Annexin A1/（ng/ml）　CA19-9/（u/ml）膽管癌組　6.314±2.957　21.558±8.250膽管結石組　1.328±0.444　2.088±0.711健康組　1.105±0.416　1.610±0.584

表5　膽管癌患者手術前后Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

表5　膽管癌患者手術前后Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

組別　Annexin A1/（ng/ml）　CA19-9/（u/ml）術前　6.314±2.957　21.558±8.250術后t值P值5.389±2.025 3.199 0.004 12.131±0.886 9.543 0.000

3　討論

膽管癌的發(fā)生、發(fā)展建立在機體本身遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的基礎上，是一個多階段、多基因協(xié)同參與的過程。Annexin A1是一類鈣依賴性磷脂結合蛋白，其N-末端含有多個潛在的磷酸化位點，具有調(diào)控Annexin A1與其他蛋白相互作用的功能，能夠與表皮生長因子受體結合，通過MAPK/ ERK信號通路影響蛋白質(zhì)復合物形成和活性，抑制細胞周期D1期表達，減少細胞增殖［7-9］。Annexin A1的異常表達可造成細胞生長紊亂，從而影響腫瘤的發(fā)生，而其在多種惡性腫瘤組織中也存在不同的表達［10-11］。Annexin A1在胃食管交界處腺癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌中表達增強，在鼻咽癌、頭頸部鱗癌、食管鱗狀細胞癌、前列腺癌中表達降低，該表達水平迥異未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律，依目前的研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其在鱗狀細胞癌中多表達降低，而在腺癌組織中表達多呈升高趨勢。本研究中采用免疫組織化學法檢測Annexin A1主要表達于膽管癌細胞的胞漿和胞膜中，并且在癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁不典型增生組織和非腫瘤膽管組織。在Annexin A1與膽管癌的臨床病理特征之間的關系中，筆者發(fā)現(xiàn)，臨床TNM分期越晚的病理Annexin A1陽性率越高；病理分化越低的組織中，Annexin A1表達越高；在伴有淋巴結轉移組中，Annexin A1表達高于不伴有淋巴結轉移組。提示Annexin A1在正常膽管組織中有一定的生理作用，而且參與正常膽管上皮到惡性腫瘤的演變過程。

CA19-9是一種糖鏈抗原，由單克隆抗體116NS 19-9識別，在血清中表達為黏蛋白糖脂，在組織中表達為單涎酸神經(jīng)節(jié)糖苷脂［12］?？煞植荚谡Ｈ说囊认佟⒛懝苌掀さ忍?，是目前臨床上用于診斷膽管癌、胰腺癌最重要的指標，敏感性高［13］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中CA19-9的表達水平由非腫瘤膽管組織、癌旁組織到膽管癌組織呈增強趨勢，無淋巴結轉移的膽管癌組織中CA19-9表達低于伴有淋巴結轉移組，提示CA19-9與膽管癌的發(fā)生和淋巴結轉移有關。

此外，筆者在對3組不同血清檢測發(fā)現(xiàn)，膽管癌組中Annexin A1、CA19-9的表達均明顯高于膽管結石組和健康組，再次驗證兩者在膽管癌的發(fā)生和發(fā)展中起著一定作用。楊盡暉等報道中［14］，CA19-9作為膽管癌診斷的一個重要指標，血清中的敏感性為79%，特異性為89%，且在行手術切除后，患者血清中CA19-9明顯下降。而目前關于Annexin A1在血清含量及其降解的研究較少。本實驗中發(fā)現(xiàn)，Annexin A1在膽管癌組術前中的表達高于術后。由此筆者推測兩者可作為膽管癌、手術診斷、手術效果判定及腫瘤轉移復發(fā)的輔助指標。

綜上所述，筆者通過免疫組織化學和酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現(xiàn)，Annexin A1在膽管癌中的高表達提示其可能成為腫瘤治療的一個新的干預靶點，調(diào)控其表達或其介導的信號轉導通路［15］，并由此發(fā)現(xiàn)治療膽管癌的新藥物。聯(lián)合檢測Annexin A1和CA19-9的表達，可為膽管癌診斷及預后評估提供參考依據(jù)。

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（張蕾編輯）

論著

Expressions of Annexin A1 and CA19-9 in cholangiocarcinoma and their clinicopathological significance

Liao Li1，Jin Wang2，Pei-zhong Shang2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China；2. Department of General Surgery，the 251st Hospital of PLA，Zhangjiakou，Hebei 075000，China）

Abstract：Objective To investigate the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in cholangiocarcinoma and their correlations with clinical and pathological features. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in 54 samples of cholangiocarcinoma and the surrounding tissues and 15 samples of non-carcinoma bile duct tissue. Statistical analysis was performed with reference to the related clinical and pathological features. Enzyme -linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in the serum of 24 healthy volunteers，24 patients with bile duct stones and 24 cases of bile duct carcinoma. Results The positive expression rates of Annexin A1 and CA19-9 in the cholangiocarcinoma were significantly higher than those in the peri-carcinoma tissue and non-carcinoma bile duct tissue（P＜0.05）. The positive expression of Annexin A1 was correlated with the pathological grades，clinical stages and lymph node metastasis of cholangiocarcinoma（P＜0.05）. The positive expression of CA19-9 was correlated with the lymph node metastasis of cholangiocarcinoma（P＜0.05）. The expression of Annexin A1 in the cholangiocarcinoma was positivelybook=32,ebook=37correlated with that of CA19-9（r = 0.356，P＜0.05）. The results of ELISA indicated that the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in serum of the cholangiocarcinoma patients were significantly higher than those in the patients with bile duct stones and the healthy volunteers（P＜0.05）. In the cholangiocarcinoma patients，the expressions of Annexin A1 and CA19-9 before operation had significant differences from those after operation（P＜0.05）. Conclusions The positive expressions of Annexin A1 and CA19-9 may be correlated with carcinogenesis，development and lymph node metastasis of cholangiocarcinoma. The combined detection of the above markers possibly has certain referential value in diagnosis of cholangiocarcinoma and its prognosis.

Keywords：cholangiocarcinoma；Annexin A1；CA19-9

中圖分類號：R735.8

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.007

文章編號：1005-8982（2016）10-0031-05

收稿日期：2015-12-02

［通信作者］尚培中，E-mail：spz251@163.com；Tel：18903138087