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（湖北省丹江口市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北丹江口442700）

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高膽固醇對(duì)小鼠原代成骨細(xì)胞Akt/NF-κB信號(hào)通路的影響

鄧?yán)?，宋?/p>

（湖北省丹江口市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北丹江口442700）

摘要：目的觀察高膽固醇對(duì)原代成骨細(xì)胞Akt/NF-κB信號(hào)通路的影響。方法將小鼠原代成骨細(xì)胞按1×105接種于6孔板上，待細(xì)胞融合至80%左右，分別加入0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的膽固醇溶液培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）的方法，檢測(cè)成骨細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子kappa B （NF-κB）和蛋白激酶B（Akt）的蛋白表達(dá)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)成骨細(xì)胞中人白細(xì)胞介素1α （IL-1α）、人白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的信使RNA（mRNA）表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1α、IL-6和TNF-α的蛋白水平。結(jié)果膽固醇誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中NF-κB的增加和Akt磷酸化水平降低，增加IL-1α、IL-6與TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)，且呈一定的劑量依賴性。結(jié)論高膽固醇可以通過Akt/NF-κB信號(hào)通路及其介導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)參與成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞：成骨細(xì)胞；NF-κB；Akt；膽固醇

膽固醇水平與骨質(zhì)疏松直接相關(guān)［1-3］，高膽固醇血癥增加骨吸收、降低骨形成［4］。高膽固醇與原發(fā)性骨質(zhì)疏松有一定關(guān)系，如對(duì)絕經(jīng)期、老年性原發(fā)骨質(zhì)疏松患者激素替代治療可以減少骨質(zhì)流失，提高骨密度，同時(shí)可見膽固醇降低［5-7］。高膽固醇對(duì)繼發(fā)性性骨質(zhì)疏松也有一定的作用，如糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的股骨頭壞死可見膽固醇升高［8］，膽固醇升高還可作為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床指標(biāo)［9］。膽固醇及其代謝產(chǎn)物可以抑制成骨細(xì)胞活性、降低骨鹽沉積最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松［10-11］。他汀類藥物可降低血清膽固醇，刺激骨形成、減少骨流失，與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因（bone morphogenetic protein 2，BMP2基因）表達(dá)增加有關(guān)，適當(dāng)劑量的他汀類藥物可用于治療骨質(zhì)疏松［12］。成骨細(xì)胞對(duì)骨組織的生長發(fā)育、骨代謝平衡、骨量平衡和骨損傷修復(fù)有著關(guān)鍵作用。因此，在高膽固醇血癥導(dǎo)致骨質(zhì)疏松病理生理過程中，其對(duì)成骨細(xì)胞的影響起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用原代成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)觀察高膽固醇對(duì)Akt/NF-κB信號(hào)通路的影響從而探討高膽固醇誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松發(fā)生的作用和可能的分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1一般材料

C57BL/6小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購自美國Gibico公司，RNA提取試劑Trizol和熒光試劑SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均購自日本TaKaRa公司，蛋白提取試劑RIPA、PMSF、NaF、Na3VO4和BCA蛋白測(cè)定試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，NF-κB抗體購自美國Abcam公司，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）及p-Akt抗體均購自美國CST公司，β-actin抗體、HRP標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。IL-1α、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒購自晶美生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定取20只出生24 h內(nèi)的小鼠，引頸處死，75%酒精浸泡10 min。無菌的條件下取出顱蓋骨浸泡在D-Hanks液中。分別剪成0.1 mm×0.1 mm×0.1 mm的組織塊，加入10 ml 0.25%的胰蛋白溶液，37℃孵育30 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入0.2%膠原酶10 ml，37℃孵育2 h，每5 min震蕩1次。1 000 r/min離心5 min，棄上清。用DMEM培養(yǎng)基沖洗3次。200目濾網(wǎng)過濾去除骨碎片。收獲細(xì)胞以完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液）重懸，吹打均勻，接種至多個(gè)25 cm2培養(yǎng)瓶。放入37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每48h換液1次，細(xì)胞融合成單層至80%以上時(shí)，0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，采用差速貼壁法進(jìn)行成骨細(xì)胞純化。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，堿性磷酸酶活性檢測(cè)鑒定成骨細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞處理分組實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞主要按照以下分組進(jìn)行處理，收集第4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將原代成骨細(xì)胞按1×105接種于6孔板上。將膽固醇溶于乙醇溶液，待細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)時(shí)加入不同濃度的膽固醇溶液，膽固醇終濃度為0μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，乙醇濃度為0.25%，對(duì)照組為只含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-PCR）細(xì)胞按上述分組進(jìn)行處理，用不同濃度膽固醇溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，離心管收集培養(yǎng)上清液備用，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，用Trizol法提取原代成骨細(xì)細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用RT-PCR檢測(cè)目的基因，用2-ΔΔCt值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。其中人白細(xì)胞介素6 （interleukin 6，IL-6）基因引物正向序列：5'-GAAATC GTGGAAATGAG-3'；反向：5'-TAGGTTTGCCGAGTA GA-3'。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）基因正向引物：5'-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT -3'；反向：5'-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3'。人白細(xì)胞介素1α（interleukin 1α，IL-1α）基因引物正向序列：5'-CTCTAGAGCACCATGCTACAG-3'；反向：5'-TTGGAATCCAGGGGAAACACT-3'。內(nèi)參β-actin基因引物正向序列：5'-GCTGTCCCTGTATG CCTCT-3'；反向：5'-GATGTCACGCACGATTTCC-3'。

1.2.4酶聯(lián)免疫分析（Elisa）采用酶聯(lián)免疫試劑盒，按試劑說明進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處光密度（optical density，OD）值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡分析（Western blot）提取原代成骨細(xì)胞蛋白并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取60μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST 洗3次，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后加ECL試劑反應(yīng)，顯像、成像。用目的條帶與β-actin的灰度值比較表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素ANOVA分析，用LSD-t檢驗(yàn)或SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1膽固醇對(duì)成骨細(xì)胞IL-1α、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

按上述方法分離小鼠原代成骨細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)鑒定，可見大量染色陽性細(xì)胞，細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)顆粒染色呈藍(lán)黑色顆粒，鑒定結(jié)果見圖1。成功分離的成骨細(xì)胞接種6孔板，并用不同濃度的膽固醇刺激成骨細(xì)胞24 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定IL-1α、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)。0μg/ml組與對(duì)照組比較各炎癥因子的表達(dá)基本無變化，說明酒精溶酶基本不影響本實(shí)驗(yàn)中炎癥因子的表達(dá)。不同濃度膽固醇顯著誘導(dǎo)IL-1α、IL-6及TNF-α 的mRNA水平，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，見圖2。本結(jié)果提示在成骨細(xì)胞中膽固醇與炎癥因子IL-1α、IL-6和TNF-α的mRNA水平呈正相關(guān)。

圖1　成骨細(xì)胞第2代堿性磷酸酶染色（×400）

圖2　不同濃度的膽固醇對(duì)成骨細(xì)胞IL-1α、IL-6和TNF-α mRNA的影響

2.2膽固醇對(duì)成骨細(xì)胞IL-1α、IL-6和TNF-α分泌水平的影響

如附表所示，不同濃度的膽固醇刺激成骨細(xì)胞24 h后，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分泌IL-1α、IL-6和TNF-α的水平變化。0μg/ml組與對(duì)照組比較，IL-1α、IL-6及TNF-α均無明顯變化；12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml組均能顯著誘導(dǎo)IL-1α、IL-6及TNF-α的水平。說明膽固醇可以促進(jìn)IL-1α、IL-6和TNF-α的分泌，且IL-6的分泌與膽固醇濃度呈正相關(guān)。

2.3膽固醇對(duì)成骨細(xì)胞Akt和NF-κB信號(hào)通路的影響

如圖3A與3B所示，膽固醇刺激成骨細(xì)胞后Western blot測(cè)定不同處理組蛋白變化，與對(duì)照組比較，12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml 3組中NF-κB水平均顯著增加（P＜0.01），而p-Akt水平顯著降低（P＜0.01）。提示：成骨細(xì)胞中膽固醇濃度與NF-κB蛋白表達(dá)一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)（P＜0.01），膽固醇濃度與成骨細(xì)胞Akt磷酸化水平一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3C與3D。

附表　不同濃度的膽固醇對(duì)成骨細(xì)胞分泌IL-1α、IL-6 和TNF-α的影響（n=8，pg/ml，±s）

附表　不同濃度的膽固醇對(duì)成骨細(xì)胞分泌IL-1α、IL-6 和TNF-α的影響（n=8，pg/ml，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P＜0.01

組別　IL-1α　IL-6　TNF-α對(duì)照組　2.21±0.08　 6.28±0.14　 36.05±0.06 0μg/ml組　2.58±0.06　 6.30±0.38　 37.73±0.30 12.5μg/ml組　4.25±0.14?　10.63±1.28?　51.75±3.30?25μg/ml組　3.97±0.17?　16.08±1.05?　52.47±1.48?50μg/ml組　4.36±0.18?　18.77±1.25?　58.69±3.09?

圖3　不同濃度膽固醇對(duì)成骨細(xì)胞Akt和NF-κB信號(hào)通路的影響

3　討論

Akt信號(hào)通路及靶基因?qū)欠只?、骨形成和骨重建都有著關(guān)鍵調(diào)控作用。血漿網(wǎng)膜素-1 （omentin-1）和胰島素可以通過增加Akt的磷酸化水平，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。敲除Akt1/Akt2的小鼠骨化延遲，敲除Akt2對(duì)BMP2沒有影響，但可通過對(duì)骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）基因的調(diào)控阻斷骨髓基質(zhì)細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化［13］。Akt磷酸化可以抑制糖皮激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。NF-κB廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞中，其激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生理病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。NF-κB與骨代謝密切相關(guān)，γ射線可導(dǎo)致NF-κB活化，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。NF-κB p50激活后也可刺激成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分泌集落刺激因子1（colony-stimulating factor 1，CSF-1），其在骨的重建中有著重要作用。TNF-α可以刺激成骨細(xì)胞NF-κB蛋白與其內(nèi)源性抑制因子核因子抑制蛋白-κB（nuclean factor-kappa B，IκBα）的解離，短時(shí)間可見核周NF-κB蛋白濃度增加，并迅速入核調(diào)控目的基因，導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡［14］。NF-κB的抑制劑PMMA可以有效阻斷間質(zhì)細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞的分化［15］，骨保護(hù)素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）與NF-κB配體核因子KB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）結(jié)合使基質(zhì)金屬蛋白酶9（matix metalloproteinase 9，MMP9）表達(dá)增高，阻斷破骨細(xì)胞的生成、抑制骨的再吸收。本研究結(jié)果顯示，膽固醇濃度與Akt的磷酸化水平負(fù)相關(guān)，與NF-κB的表達(dá)正相關(guān)，提示膽固醇可能通過NF-κB與Akt信號(hào)通路介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化過程。

PI3K/Akt是調(diào)節(jié)NF-κB及下游基因表達(dá)的重要信號(hào)通路。過表達(dá)的胰島素受體底物1（insulin receptor 1，IRS1）可通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制NF-κB和其下游BAX基因（Bcl2-associated X protein，BAX）的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，且上述作用可以被PI3K的抑制劑LY294002所逆轉(zhuǎn)［16］。PI3K/Akt磷酸化后，激活NF-κB及其調(diào)控下游細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1α及IL-6的釋放［17］。TNF-α、IL-1α、IL-6等炎癥介質(zhì)的分泌可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)，不僅對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸收有明顯促進(jìn)作用，而且還能影響成骨細(xì)胞性骨形成。TNF-α能夠抑制膠原合成、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性和骨鈣素合成，同時(shí)可以通過NF-κB途徑增加IL-6、IL-1α和ICAM1基因的表達(dá)從而增加骨質(zhì)流失。IL-6在骨更新中有著重要作用，成骨細(xì)胞分泌的IL-6與多種細(xì)胞因子共同作用促進(jìn)骨吸收和骨重建［18，19］。本研究觀察結(jié)果顯示，高膽固醇促進(jìn)TNF-α、IL-1α與IL-6表達(dá)，而且表達(dá)水平與膽固醇濃度正相關(guān)，提示高膽固醇可能通過Akt/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而影響成骨細(xì)胞分化過程。

綜上所述，高膽固醇可能通過抑制Akt活性激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，從而影響成骨細(xì)胞分化，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)失衡而增加骨質(zhì)疏松發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

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（張蕾編輯）

論著

Effects of high-level cholesterol on Akt/NF-κB signaling pathway of mouse primary osteoblasts

Li Deng，Dan Song
（Department of Laboratory，Danjiangkou First Hospital，Danjiangkou，Hubei 442700，China）

Abstract：Objective To observe the effects of high-level cholesterol on Akt/NF-κB signaling pathway of primary osteoblasts. Methods Mouse primary osteoblasts were seeded at 1×105to 6-well plates. At 80%fusion，the cells were stimulated with 0 μg/ml，12.5 μg/ml，25 μg/ml and 50 μg/ml cholesterol solution culture medium respectively for 24 hours. The protein levels of NF-κB and phosphorylation of Akt were detected by Western blot. The levels of IL-1α，IL-6 and TNF-α were detected by RT-qPCR and ELISA. Results High-level cholesterol increased the NF-κB protein level and decreased phosphorylation of Akt. High-level cholesterol increased not only the mRNA levels but also protein levels of IL-1α，IL-6 and TNF-α. Conclusions Together，these results have uncovered a role of cholesterol in osteoblasts and provided the evidence that treatment with cholesterol at a high dosage may influence the levels of inflammatory factors through Akt/NF-κB signaling pathway in osteoblasts.

Keywords：osteoblast；NF-κB；AKT；cholesterol

中圖分類號(hào)：R589.9；R-332

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.002

文章編號(hào)：1005-8982（2016）10-0006-05

收稿日期：2015-10-26