胡宗苗　劉景楠　周園里　鄧穎穎　劉繼平

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 (咸陽(yáng) 712046)

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靈芝孢子粉對(duì)乙醇誘導(dǎo)小鼠胃潰瘍的保護(hù)作用*

胡宗苗劉景楠周園里鄧穎穎劉繼平△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 (咸陽(yáng) 712046)

摘要目的：探討靈芝孢子粉對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍的保護(hù)作用。方法：BABL/C小鼠灌胃給予0.2mL乙醇制備酒精性胃潰瘍模型。隨后將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、奧美拉唑組(2 mg/kg)、靈芝孢子粉低、高劑量組(0.5 g/kg、1g/kg)，各給藥組造模前1h給予藥物，造模后4h取血清測(cè)定SOD、MDA、IL-6、TNF-α，胃組織HE染色觀察病理學(xué)改變，蛋白免疫印跡法檢測(cè)胃組織中NF-кBP65、COX-2蛋白表達(dá)。結(jié)果: 靈芝孢子粉對(duì)乙醇所致胃潰瘍病理學(xué)改變有所減輕，可有效降低小鼠胃潰瘍指數(shù)，顯著提高血清中SOD水平，降低MDA及IL-6、TNF-α水平，減低NF-кBP65、COX-2蛋白表達(dá)。結(jié)論：靈芝孢子粉對(duì)乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍有一定保護(hù)作用，主要通過(guò)抗氧化及抗炎機(jī)制。

主題詞 胃潰瘍/中醫(yī)藥療法@靈芝孢子粉動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠

大量酗酒或飲用高濃度酒可引起淺表性潰瘍或急性胃黏膜糜爛，被稱為急性酒精性胃潰瘍，屬胃粘膜急性受損的常見(jiàn)類型。因日常飲酒后酒精30%在胃吸收，故此直接對(duì)胃產(chǎn)生損傷，志愿者內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)單次大量飲酒可能導(dǎo)致胃黏膜糜爛甚至出血[1]。體內(nèi)外H2O2、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等刺激均可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB，在炎癥中起至關(guān)重要的作用。炎癥因子COX-2則可被脂多糖、白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、血小板生長(zhǎng)因子及其他因素誘發(fā)并經(jīng)p38MAPK信號(hào)系統(tǒng)級(jí)聯(lián)傳遞而產(chǎn)生[2]。靈芝孢子粉是靈芝生長(zhǎng)成熟后所散發(fā)出來(lái)的孢子體，富含多種氨基酸，脂肪酸，多糖肽，有機(jī)鍺及微量元素。臨床報(bào)道其可改善免疫功能，減輕癌癥患者放、化療不良反應(yīng)。而藥理研究也表明，靈芝孢子粉可增強(qiáng)免疫，抑制多種移植性動(dòng)物腫瘤。本研究采用乙醇制備小鼠急性胃潰瘍模型，探討靈芝孢子粉對(duì)其保護(hù)作用及機(jī)制。

1材料和方法1.1藥物與試劑全破壁赤靈芝孢子粉，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)白工坊科貿(mào)有限公司(批號(hào): 20140903)。給藥前無(wú)菌蒸餾水溶解干粉，配置成濃度1g/mL的液體。丙二醛(MDA)試劑盒(20141105)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(20141110)，白介素-6(IL-6)測(cè)試盒(20141030)、 腫瘤壞死因子(TNF-α)測(cè)試盒(20141030)，均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司； COX-2、NF-кB抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；乙醇購(gòu)自于吉林省金泰化學(xué)試劑有限公司。

1.2動(dòng)物BABL/C小鼠，雌性，體重18～22g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-006；動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(KX-21，美國(guó)SYSMEX)，Mini-Protean Tetra垂直電泳槽(美國(guó)伯樂(lè))、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)伯樂(lè))、TS1-000脫色搖床(其林貝爾)、702超低溫冰箱(美國(guó)熱電)、TGL-16M高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)。

1.4方法1.4.1造模與給藥:取小鼠50只，隨機(jī)分為空白組、模型組、奧美拉唑組、靈芝孢子粉低、高劑量組，每組10只，除空白組外其余各組灌胃給予乙醇0.2mL/只，各給藥組分別在給予乙醇前1h分別給予奧美拉唑(0.02 g/Kg)、靈芝孢子粉 (0.5g/Kg，1g/Kg)，4h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，取血清及胃組織測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.2指標(biāo)檢測(cè):嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中SOD、MDA、IL-6、TNF-α含量； 4%多聚甲醛固定胃組織，石蠟包埋，切片并行HE染色，光鏡下觀察胃組織病理改變。Western blot：冰冷裂解液處理胃組織并收集總蛋白，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；室溫封閉2h之后分別與NF-кBP65、COX-2一抗孵育，漂洗膜后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗反應(yīng)，結(jié)束后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法( ECL) 發(fā)光試劑顯影，光密度值用灰度成像軟件(UVP，UK) 測(cè)定并計(jì)算NF-кBP65、COX-2蛋白表達(dá)。

2結(jié)果2.1血清SOD、MDA含量與空白組比較，乙醇誘導(dǎo)的模型組小鼠血清SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.01)，而靈芝孢子粉組小鼠血清SOD活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)，MDA含量顯著下降(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.2 血清IL-6、TNF-α含量與空白組比較，乙醇誘導(dǎo)的模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量明顯升高(P<0.05)，而靈子孢子粉組小鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯降低(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表 2。

2. 3胃組織病理學(xué)胃組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，空白組小鼠黏膜層組織結(jié)構(gòu)層次清楚，上皮完整，連續(xù)性好，腺體排列整齊。模型組小鼠可見(jiàn)部分黏膜上皮細(xì)胞受損脫落，腺體腫脹，結(jié)構(gòu)破壞，凝固性壞死，有灶狀糜爛出血，固有膜毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，但未累及黏膜肌層，靈芝孢子粉組上述變化明顯減輕，見(jiàn)圖1。

表1　靈芝孢子粉對(duì)血清 SOD、MDA 的影響

注：與模型組比較:△P<0.05, ▲P<0.01

表2　靈芝孢子粉對(duì)IL-6和TNF-α的影響

注：與模型組比較: △P<0.05, ▲P<0.01

2.4胃組織中NF-кBP65、COX-2蛋白水平與空白組比較，乙醇誘導(dǎo)的模型組小鼠胃組織中NF-кBP65、COX-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；靈芝孢子粉組胃組織中NF-кBP65、COX-2蛋白水平明顯降低 (P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖2及表3。

A.空白組; B.模型組; C.奧美拉唑組(0.02g/Kg); D.靈芝孢子粉組(0.5g/Kg); E. 靈芝孢子粉組(1g/Kg)

A.空白組; B.模型組; C.奧美拉唑組(20mg/Kg); D. 靈芝孢子粉組(0.5g/Kg); E.靈芝孢子粉組(1g/Kg)

圖2　胃組織中NF-кBP65、COX-2蛋白表達(dá)

注：與模型組比較: △P<0.05, ▲P<0.01

3討論酒精具有很高的親脂性和脂溶性，可刺激胃酸分泌，增加 H+反彌散，損傷正常代謝進(jìn)而破壞細(xì)胞功能，破壞胃黏膜內(nèi)及黏膜下組織結(jié)構(gòu)，是重要的胃黏膜攻擊性因子[3]，故大量酗酒或飲用高濃度酒均可引起急性胃黏膜淺表性損害。研究顯示，在絕大多數(shù)致潰瘍因子的致病過(guò)程中有氧自由基的參與，其機(jī)制可能與共價(jià)鍵結(jié)合性損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化損害有關(guān)。氧自由基引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)形成相應(yīng)的產(chǎn)物MDA，MDA 可與蛋白質(zhì)、核酸等大分子結(jié)合形成脂褐質(zhì)沉積于細(xì)胞中，造成細(xì)胞損傷，而人體內(nèi)有完善的自由基清除系統(tǒng)，SOD即是其中的重要酶類[4]；NF-кB是炎癥反應(yīng)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)IL-6、IL-1、TNF-α等重要的促炎細(xì)胞因子分泌，這些因子的大量合成與釋放會(huì)造成炎癥反應(yīng)[5-7]，而COX-2則可促進(jìn)炎癥介質(zhì)PG生物合成，引起炎癥。

靈芝孢子粉是靈芝成熟后散發(fā)出的孢子體，臨床報(bào)道其可改善機(jī)體的免疫功能，防治癌癥等作用。本文采用灌胃乙醇建立小鼠酒精性胃潰瘍模型，評(píng)價(jià)靈芝孢子粉對(duì)酒精性胃潰瘍的保護(hù)作用并探討其初步機(jī)制，研究結(jié)果顯示，靈芝孢子粉能顯著提高乙醇誘導(dǎo)的急性酒精性胃潰瘍模型小鼠血清中SOD活性；降低MDA及炎癥因子IL-6、TNF-α含量，顯著改善模型小鼠胃粘膜的病理改變，同時(shí)降低胃組織中NF-кBP65、COX-2蛋白表達(dá)水平，提示靈芝孢子粉可能是通過(guò)抗氧化及抗炎等環(huán)節(jié)發(fā)揮胃粘膜保護(hù)作用。

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(收稿2015-12-03；修回2016-01-13)

Lingzhi Baozifen(LZBF) attenuates stomach inflammation induced by ethanol in mice

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Hu ZongmiaoLiu JingnanZhou Yuanlietal

ABSTRACTObjective：To determine the protective effect of Lingzhi Baozifen(LZBF) on stomach inflammation induced by ethanol in mice. Methods：The BABL/C mice were randomly allocated into control, ethanol, omeprazole (0.02g/kg)、LZBF (0.5g/kg), and LZBF (1g/kg). The blood samples were analyzed for the superoxide dismutase (SOD)、methane dicarboxylic aldehyde (MDA)、interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α), and the stomach samples were taken for histologic evaluation. The protein levels of NF-кBP65, COX-2 were detected by Western blot analysis. Results：Pretreatment with LZBF prior to the administration of ethanol significantly induced a decrease in MDA activity and in IL-6, the tumor neurosis factor-α (TNF-α) in serum and NF-кBP65 protein and COX-2 in lung. At the same time, pretreatment with LZBF also significantly improved the superoxide dismutase (SOD) activity in stomach. Conclusion:These results showed that anti-inflammatory effects of LZBF against the Alcoholic gastric ulcer.

KEY WORDSStomach ulcer/traditional Chinese medicine therapy@Lingzhi BaozifenAnimal experimentation Mice

【中圖分類號(hào)】R573.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.049

*陜西省教育廳重點(diǎn)科研計(jì)劃(15JS022)

△通訊作者