王浩宇　張江琳　李　丹　楊相笛　羅　寧　石　磊　陳　悅

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周粘膜科(西安710004)

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UPLC-MS/MS法測定復(fù)方黃芩片中黃芩苷在大鼠血漿中的濃度*

王浩宇張江琳李丹楊相笛羅寧石磊陳悅△

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周粘膜科(西安710004)

摘要目的：建立UPLC-MS/MS方法測定復(fù)方黃芩片中黃芩苷在大鼠血漿中的濃度。方法：建立黃芩苷含量測定的UPLC-MS/MS外標(biāo)分析方法。色譜柱采用C18色譜柱，流動相采用含0.1%醋酸的水-含0.1%醋酸的乙腈，梯度洗脫，在電噴霧電離(ESI)正離子模式下，采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)進(jìn)行檢測。采用清潔級雄性SD大鼠8只，7周齡，體重200±20g，給予復(fù)方黃芩片灌胃后(相當(dāng)于黃芩苷含量200mg/kg)于0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24h時間點(diǎn)用斷尾法取血0.4 mL , 置于肝素化的離心管中，5000 r/min 離心10 min，分離提取血漿，采用UPLC-MS/MS法測定血漿中黃芩苷的含量。結(jié)果：血藥濃度測定結(jié)果表明，黃芩苷的線性范圍為5～2000 μg/L，定量下限為5μg/L。低、中、高3種濃度的日內(nèi)和日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于3%，平均回收率均在80%以上。黃芩苷血藥濃度較低，血藥濃度-時間曲線表現(xiàn)為多峰現(xiàn)象。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS方法符合生物樣品分析的要求，可用于研究大鼠灌胃復(fù)方黃芩片后血漿中黃芩苷的測定。復(fù)方黃芩片口服后其主要藥理成分黃芩苷的血藥濃度較低，提示藥物的吸收利用較差。

主題詞黃芩苷/分析@UPLC-MS/MS血藥濃度

中藥黃芩為唇形科植物黃芩的根，其味苦、性寒，歸心、肺、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，主治溫?zé)岵?、肺炎、肺熱咳嗽、上呼吸道感染、咳血、高血壓、目赤、濕熱黃膽、痢疾、癰腫癤瘡、胎動不安、泌尿系統(tǒng)感染、肝炎等癥。藥物有效成分為黃酮類化合物，其中以黃芩苷的藥理作用最強(qiáng)，是黃芩及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分。黃芩苷的藥理學(xué)研究報道顯示，其具有顯著的生物學(xué)活性，具有抑菌、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、利尿、利膽、解痙、解熱、降壓、鎮(zhèn)靜等作用，并且具有較強(qiáng)的抗癌反應(yīng)等生理效能，在抗感染、抗氧化、抗腫瘤、抗HIV以及治療心血管疾病等方面具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值。

復(fù)方黃芩片為利用現(xiàn)代藥物萃取技術(shù)制成的濃縮糖衣片，主要成分有黃芩、虎杖、穿心蓮、十大功勞，輔料為蔗糖、氫氧化鋁。該藥主治急、慢性咽喉炎, 還對口腔潰瘍、泌尿系感染、上呼吸道感染、腸炎、外傷感染、痔瘡感染等也有一定療效。目前，該藥臨床多應(yīng)用于消炎解毒、涼血消腫、咽喉腫痛、口舌生瘡、感冒發(fā)熱、癰腫瘡瘍等。

有關(guān)黃芩苷體內(nèi)分析方法的研究，文獻(xiàn)報道有HPLC法[1-3]、LC-MS法[4-5]等。HPLC法靈敏度低，最低檢測限較高，而LC-MS法靈敏度高，能很好地應(yīng)用于黃芩苷的定量分析。本研究將從其血藥濃度的測定方面來探討復(fù)方黃芩片在臨床中的應(yīng)用。

1材料1.1 藥品與試劑復(fù)方黃芩片(廣東肇慶星湖制藥有限公司，批號：131008)；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物藥品檢定所)；甲醇、乙腈(高效液相色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；醋酸(質(zhì)譜純，美國Waters公司)；肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)；維生素C注射液(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司)；水為純凈水。

1.2實(shí)驗(yàn)動物清潔級雄性SD大鼠24只，7周齡，體重200±20g，動物購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.3儀器及條件Waters Acquity 高效液相色譜儀、Waters Xevo-TQD三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)。

色譜-質(zhì)譜條件：采用Waters Acquity UPLC C18色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，流動相：A相為0.1%醋酸的水溶液，B相為0.1%醋酸的乙腈溶液，流動相比率改變：初始80%A，0～0.5min 40%A，0.5～1.0min 20%A，1.0～1.5min 40%A，1.5～2.0min 60%A，2.0～2.5min 80%A，2.5～3.0min 80%A，流速為0.2mL/min。柱溫為40℃。電噴霧離子化，采用正離子MRM檢測模式，用于定量的MRM檢測離子為：黃芩苷為[M+H]+446.78→270.77。錐孔電壓為35V，碰撞能量為39eV。進(jìn)樣量5μL。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1溶液的制備對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，加8mL甲醇溶解黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，再加甲醇定容至10mL，搖勻，配制成濃度為1mg/mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。用甲醇梯度稀釋黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，配成濃度為5、10、20、50、100、200、500、1000、1500、2000ng/mL的系列黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2血漿樣品處理方法精密量取0.2 mL血漿，置于1.5 mL離心管中，加入40μL 0.1M鹽酸酸化血漿，加入40μL 0.2g/mL維生素C作為抗氧化劑，搖勻，加入1 mL甲醇-乙腈(1∶1)沉淀蛋白，渦旋混合1 min，10000 rpm離心10 min，取上清液，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.2 mL流動相渦旋溶解，10 000 rpm離心2 min，取上清液，經(jīng)C18固相萃取小柱過濾，濾液加流動相稀釋至0.5mL，取5μL進(jìn)樣分析。

2.3方法的專屬性取空白血漿0.2 mL，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，按照超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件方法進(jìn)樣，得圖1A，將一定濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)液加人空白血漿中，依上述方法操作，得圖1B，待測物黃芩苷的保留時間為1.25min；取大鼠復(fù)方黃芩片灌胃給藥后的血漿樣品，依上述方法操作，得圖1C。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物黃芩苷的測定。

圖1　黃芩苷的UPLC-MS/MS圖

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍將黃芩苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，每個濃度點(diǎn)進(jìn)行3個樣本分析，重復(fù)3個分析批，以黃芩苷的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：Y=77.018X-468.01，r=0.998549，表明黃芩苷濃度在5～2000 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，定量下限為5 ng/mL。

2.5精密度的考察分別取空白血漿0.2 mL，配制黃芩苷低、中、高3個濃度(濃度分別為10、200、1500 ng/mL)的質(zhì)量控制(QC)樣本，每個濃度進(jìn)行6個樣本，連續(xù)測定3d，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣本的測得濃度，根據(jù)測得的QC樣品濃度，計(jì)算方法的精密度，見表1。

表1　精密度結(jié)果

2.6提取回收率考察分別取空白血漿0.2 mL，配制低、中、高3個濃度的QC樣本(濃度分別為10、200、1500 ng/mL)，每個濃度進(jìn)行6個樣本分析，以待測溶液的峰面積與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液的峰面積的比值作為提取回收率，得到上述3個血漿濃度水平的QC樣品中黃芩苷的提取回收率依次為87.85%、83.92%、81.12%。

2.7穩(wěn)定性的考察分別取空白血漿0.2 mL，配制低、中、高3個濃度的QC樣品(濃度分別為10、200、1500 ng/mL)，每個濃度進(jìn)行3個樣本分析，考察其反復(fù)凍融3次，以及生物樣本處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，黃芩苷血漿樣本經(jīng)反復(fù)凍融3次，以及生物樣本處理后室溫放置24 h均較穩(wěn)定，測定值與添加值相比較，減少量均在15%之內(nèi)，見表2。

表2　穩(wěn)定性結(jié)果

2.8動物實(shí)驗(yàn)將SD大鼠禁食不禁水12h后，給予復(fù)方黃芩片劑量(相當(dāng)于黃芩苷含量200mg/kg)單次灌胃，灌胃4h后自由進(jìn)食。在0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24h時間點(diǎn)各采集0.4mL血液，加入肝素鈉溶液抗凝，離心后得0.2mL血漿，血漿樣品按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下進(jìn)行操作，按照超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件方法進(jìn)樣，測定大鼠血漿中黃芩苷的含量。

3結(jié)果

圖2　黃芩苷的血藥濃度-時間曲線

經(jīng)過方法驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)的UPLC-MS/MS方法，可快速簡便地測量血漿中黃芩苷的含量。

黃芩苷的血藥濃度-時間曲線呈多峰形態(tài)，結(jié)果見圖2，藥代動力學(xué)參數(shù)見表3。

表3　黃芩苷藥代動力學(xué)參數(shù)

4討論黃芩苷可發(fā)生氧化反應(yīng)，在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差，因此血漿中加入鹽酸以酸化血漿，加入維生素C作為還原劑，吹干上清液時采用氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣體，可以維持黃芩苷的穩(wěn)定[6-7]。

在給予大鼠復(fù)方黃芩片灌胃后，血漿中的黃芩苷的含量在20min時出現(xiàn)第一個峰值，可能與藥物在胃內(nèi)溶解吸收有關(guān)，體現(xiàn)了黃酮類化合物的快速吸收特性；黃芩苷的多峰現(xiàn)象可能與其參與肝腸循環(huán)有關(guān)[2,8]。黃芩苷先在胃內(nèi)被初次吸收，之后在小腸內(nèi)可部分轉(zhuǎn)化為黃芩素被吸收，吸收的黃芩素在組織內(nèi)又可轉(zhuǎn)化為黃芩苷，且黃芩苷可隨膽汁分泌排泄入腸，又能再次被吸收利用。

黃芩苷的血藥濃度較低，可能與其低溶解度、低滲透性有關(guān)，且復(fù)方黃芩片為片劑，黃芩苷在溶解吸收前還需要片劑成分的崩解、藥物的溶出，這些原因可能導(dǎo)致其生物利用率較低。提示需增大使用劑量或改進(jìn)生產(chǎn)制作工藝以取得較好的臨床治療效果。

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(收稿2015-12-27；修回2016-01-14)

Determination of baicalin by UPLC-MS/MS in rats plasma administered

with Fufang Huangqin tablets Department of Periodontal and Oral Mucosal Diasease，Stomatology Hospital of Xi’an Jiaotong University College of Medicine(Xi’an 710004)

Wang HaoyuZhang Jianglin Li Danetal

ABSTRACTObjective:Develop a UPLC-MS/MS method to determinating the plasma concentration of baicalin in Fufang Huangqin tablets.Methods:Develop a UPLC-MS/MS analysis method to determining the baicalin. Using C18column,mobile phase uses water containing 0.1% acetic acid - acetonitrile containing 0.1% acetic acid, and use ESI positive ion mode and MRM mode for detection.Using 8 male SD rats, 7 weeks old, weighing 200±20g. Collect 0.4 mL blood from tails at 5,10,20,30,60,120,240,360,480,600,720,960,1440 min after giving Fufang Huangqin tablets orally (Equivalent Baicalin 200mg/kg), and place it in heparinized centrifuge tube, 5000 r/min centrifuge 10 min, separate and extract the plasma for UPLC-MS/MS method to determining plasma concentration of baicalin.Results:The results show that the plasma concentration of baicalin has linear range of 5～2000 μg/L, the detection limit was 5μg/L.Inter-day and intra-day precision RSD of Low, medium, and high concentrations were not more than 3%, the average recovery was above 80%. The blood concentrations of baicalin was low, plasma concentration - time curve shows a multimodal phenomenon.Conclusion:The UPLC-MS/MS method can be successfully used for measuring the concentration of baicalin in plasma of rats.The blood concentrations of baicalin is low, indicating poor absorption and utilization of drugs.

KEY WORDSBaicalin/ Analyti@UPLC-MS/MSBlood drug level

【中圖分類號】R283

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.044

* 陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2010K12-01)

△通訊作者

·方藥縱橫·