孫棟勛，　黃棟棟，　金巧智，　陳武兵，　蔡志毅△

(1嘉興市第一醫(yī)院，浙江 嘉興 314000； 2臺(tái)州市立醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 臺(tái)州 318000)

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miRNA-7介導(dǎo)Bax和Bcl-2表達(dá)對(duì)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡的影響*

孫棟勛1，黃棟棟1，金巧智2，陳武兵2，蔡志毅2△

(1嘉興市第一醫(yī)院，浙江 嘉興 314000；2臺(tái)州市立醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 臺(tái)州 318000)

[摘要]目的： 研究過表達(dá)微小RNA-7(microRNA-7，miRNA-7)誘導(dǎo)人鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)CNE-1細(xì)胞凋亡及其與Bax和Bcl-2表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)情況。方法: 體外利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染到人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中；采用real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中miRNA-7的相對(duì)表達(dá)情況；CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力的改變；在熒光顯微鏡下利用Hoechst 33258熒光染色法觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡；real-time PCR法檢測(cè)Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平；Western blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: Real-time PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-7模擬物的CNE-1細(xì)胞中其miRNA-7的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于無關(guān)序列組和空白對(duì)照組(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miRNA-7模擬物后，CNE-1細(xì)胞的活力明顯下降(P<0.01)；Hoechst 33258染色檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化；real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-7模擬物的CNE-1細(xì)胞中Bax的mRNA及蛋白顯著上調(diào)(P<0.01)，而Bcl-2的mRNA及蛋白則顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論: 過表達(dá)miRNA-7可以通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2之間的比例關(guān)系來抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]微小RNA-7； Bax； Bcl-2； 鼻咽癌； 細(xì)胞凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)為我國(guó)南方高發(fā)的一種頭頸部惡性腫瘤，現(xiàn)已知NPC不僅與化學(xué)致癌物及EB病毒等因素有關(guān)，且是一種多基因多階段侵襲性疾病，有一定的遺傳傾向，這可能和鼻咽癌中癌基因的激活與抑癌基因的失活所引起的細(xì)胞抗凋亡有關(guān)。

微小RNA(microRNA，miRNA)是新近發(fā)現(xiàn)的又一類高度保守的非編碼小RNA分子，其在基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控方面起著至關(guān)重要的作用[1]。miRNA主要介導(dǎo)與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)的完全或不完全配對(duì)來導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或翻譯抑制來調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及分化等生物學(xué)行為，進(jìn)而發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如miRNA-17-92和miRNA-155在鼻咽癌中明顯的高表達(dá)，而miRNA-143和miRNA-145則表達(dá)下調(diào)[3]。但是關(guān)于鼻咽癌中miRNA的研究仍主要集中在鼻咽癌內(nèi)以及EB病毒自身合成miRNA表達(dá)譜的建立，而對(duì)于鼻咽癌中miRNA精細(xì)調(diào)控的研究仍處于初級(jí)階段，鼻咽癌組織中異常表達(dá)miRNA的確切調(diào)控機(jī)制以及miRNA與鼻咽癌組織中靶基因特異性結(jié)合位點(diǎn)和機(jī)制都有待進(jìn)一步的深入研究。

miRNA-7是近期發(fā)現(xiàn)的在某些腫瘤中具有抑癌作用的微小RNA，這些腫瘤包括胃癌[4]、乳腺癌[5]和肝癌[6]等。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7在體外可以顯著抑制低分化鼻咽癌5-8F細(xì)胞的惡性增殖活動(dòng)[7]，本研究擬通過miRNA基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來打破凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2之間的平衡關(guān)系，借以探討miRNA-7在體外對(duì)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞抗凋亡作用的相關(guān)影響機(jī)制，并探索尋找鼻咽癌新的miRNA活性特異性治療靶點(diǎn)的可行性。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

人高分化鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。RPMI-1640培養(yǎng)基、OPTI-MEM I培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；PBS緩沖液(Thermo)；CCK-8試劑盒(Bryotime)；總RNA抽提試劑TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Lipo 2000)及miRNA第一鏈合成試劑盒(Invitrogen)；cDNA第一鏈合成試劑盒和RealMasterMix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒(Tiangen)；兔抗人GAPDH、Bax、Bcl-2單克隆 I 抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(Bioworld)。miRNA-7模擬物及陰性對(duì)照(negtive control，NC)序列由廣州銳博生物合成。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)CNE-1細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分為3組：miRNA-7組；NC組；空白對(duì)照 (mock)組。將CNE-1細(xì)胞以每孔3×105接種到6孔板中，每孔2.5×103接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，并按操作說明以等量OPTI-MEM I無血清培養(yǎng)基分別稀釋適當(dāng)量的miRNA-7/NC與Lipo 2000，輕輕混勻后室溫靜置5 min，再將兩者輕輕混勻于室溫下共孵育15～20 min，加入6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。如若轉(zhuǎn)染帶熒光的Cy3-miRNA-7或Cy3-NC時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)操作均需避光，并以錫箔紙包被6孔板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后用PBS沖洗，于熒光顯微鏡下觀察大致轉(zhuǎn)染效率并拍照。

2.2Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miRNA-7的相對(duì)表達(dá)情況各組CNE-1細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理48 h后，提取細(xì)胞總RNA，紫外分光度計(jì)下測(cè)A260/A280比值處于1.8～2.1之間的RNA即符合純度要求。配制miRNA逆轉(zhuǎn)錄液合成cDNA，并稀釋10倍待用，配制 real-time PCR反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PCR反應(yīng)步驟為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，并以U6作為內(nèi)參照。記錄各孔Ct值，取各孔平均值作為最終結(jié)果，并采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。miRNA-7的上游引物序列為5’-AAA-AAGAACACGTGGAAGGATAG-3’，下游引物序列為5’-CCGCCTAACGTACCGCGAATTT-3’。U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力取96孔板按上述轉(zhuǎn)染法處理各組CNE-1細(xì)胞，于空白孔中加無細(xì)胞的完全培養(yǎng)基(每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取4個(gè)復(fù)孔)，培養(yǎng)48 h后向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，混勻后放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，測(cè)450 nm波長(zhǎng)下每孔的吸光度(A)值。

2.4Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1細(xì)胞以每孔3×105個(gè)接種于放有蓋玻片(多聚賴氨酸包被)的6孔板內(nèi)，待24 h后分別轉(zhuǎn)染，經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS輕洗2次，每孔加4%多聚甲醛1 mL，于4 ℃固定10 min，從6孔板中取出玻片，吸水紙吸去多余固定液，避光條件下每個(gè)玻片滴加Hoechst 33258染液100 μL，室溫下孵育10 min，吸水紙吸去多余染液，熒光顯微鏡下觀察、攝像。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在熒光顯微鏡下觀察。

2.5Real-time PCR檢測(cè)Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況抽提各組CNE-1細(xì)胞總RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液合成cDNA后，采用SYBR Green熒光染料法配制PCR反應(yīng)體系，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。PCR反應(yīng)步驟：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)以GAPDH作為內(nèi)參照。記錄各孔Ct值，取3孔平均值作為最終結(jié)果，并采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。GAPDH的上游引物序列為5’- CAT CAGCAATGCCTCCTGCAC-3’，下游引物序列為5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’； Bax的上游引物序列為5’-ATGGAGCTGCAGAGGATTCG-3’，下游引物序列為5’-AATGTCCAGCCCATGATGGT-3’；Bcl-2的上游引物序列為5’-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3’，下游引物序列為5’-CGGTGCTTGGCAATTAGTGG-3’。

2.6Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況于6孔板中轉(zhuǎn)染各組CNE-1細(xì)胞72 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌1次后加入200 μL 1×SDS loading buffer，反復(fù)吹打攪拌至細(xì)胞充分裂解，95 ℃～100 ℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液作為樣本蛋白。按順序加樣，電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉1.5 h，TBST充分洗膜，加特異性 I 抗(GAPDH，1∶10 000稀釋；Bax和Bcl-2均1∶1 000稀釋)，放置于4 ℃孵育過夜，加入 II抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1.5 h，TBST充分洗膜，加入ECL發(fā)光液2 min后于ImageQuant LAS 4000 Mini凝膠成像儀中自動(dòng)曝光，并分析各條帶灰度值，計(jì)算各條帶組與內(nèi)參照GAPDH灰度的相對(duì)比值。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表明，多個(gè)樣本均數(shù)之間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)進(jìn)行分析，所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

如圖1所示，用帶有Cy3熒光蛋白的Cy3-miRNA-7或 Cy3-NC轉(zhuǎn)染人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞24 h后，于熒光顯微鏡下拍照并觀察大致轉(zhuǎn)染效率，觀察到轉(zhuǎn)染效率在90%左右。

Figure 1.The expression of Cy3 fluorescin in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells 24 h after transfection (×100).

圖1鼻咽癌CNE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下Cy3熒光蛋白的表達(dá)情況

2miRNA-7在CNE-1細(xì)胞中的表達(dá)情況

miRNA-7在miRNA-7組、NC組及mock組中相對(duì)于U6的表達(dá)量分別為136.00±1.28、1.06±0.03和1.12±0.02，顯示轉(zhuǎn)染后miRNA-7組miRNA-7的表達(dá)量相對(duì)NC 組及Mock組呈明顯上調(diào)趨勢(shì)(P<0.01)，NC組和Mock組之間則差異不明顯，見圖2。

Figure 2.The expression of miRNA-7 in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells after transfection with miRNA-7 mimics. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miRNA-7.

圖2轉(zhuǎn)染后人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中miRNA-7的相對(duì)表達(dá)情況

3miRNA-7抑制CNE-1細(xì)胞活力

CNE-1細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-7/NC處理48 h后，miRNA-7組的A值明顯小于NC組和mock組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，而NC組和mock組之間相比則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3. The activity of human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells 48 h after transfection with miRNA-7 mimics was detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miRNA-7.

圖3CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-7 48 h后各組細(xì)胞活力的變化

4miRNA-7促進(jìn)CNE-1細(xì)胞凋亡形成的情況

如圖4所示，NC和mock組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后可見細(xì)胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，紫外光下呈淡藍(lán)色熒光；而miRNA-7組細(xì)胞可見染色質(zhì)凝聚且分布不均勻，呈顆粒團(tuán)狀分布，部分細(xì)胞核縮小，有的核碎裂形成多個(gè)球形顆粒，出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為亮藍(lán)色的核固縮和核碎裂呈分葉狀。NC組和mock組則無明顯細(xì)胞核破壞現(xiàn)象。

Figure 4. Nuclear morphological changes observed by Hoechst staining 24 h after transfection with miRNA-7 mimics or negative control (×400).

圖4Hoechst染色檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后的核形態(tài)變化

5miRNA-7對(duì)Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

miRNA-7組和NC組Bax的mRNA表達(dá)量相對(duì)于mock組分別為1.36±0.03、1.07±0.02，而Bcl-2的 mRNA表達(dá)量則分別為0.75±0.02、0.94±0.01，miRNA-7組CNE-1細(xì)胞中Bax的mRNA表達(dá)量與NC組和mock組相比均明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，而Bcl-2的mRNA表達(dá)量與NC組和mock組相比均明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。NC組和mock組Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 5. The effect of miRNA-7 transfection on the mRNA expression of Bax/Bcl-2 in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs NC;##P<0.01vsmock.

圖5miRNA-7對(duì)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

6miRNA-7對(duì)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

miRNA-7組、NC組和mock組Bax蛋白相對(duì)內(nèi)參照的表達(dá)量分別為0.38±0.02、0.20±0.02和0.17±0.01，Bcl-2蛋白相對(duì)內(nèi)參照的表達(dá)量則分別為0.19±0.01、0.41±0.02和0.45±0.02，提示miRNA-7組CNE-1細(xì)胞中的Bax蛋白表達(dá)量與NC組和mock組相比均明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，而Bcl-2的蛋白表達(dá)量與NC組和mock組相比則均明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。NC組和mock組的Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 6. The effect of miRNA-7 transfection on the protein expression of Bax/Bcl-2 in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miRNA-7.

圖6miRNA-7轉(zhuǎn)染對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞對(duì)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響

討論

miRNA是一類長(zhǎng)度約19～25個(gè)寡核苷酸序列的非編碼小RNA，在真核細(xì)胞增殖、凋亡等多個(gè)生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。miRNA 可以形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)來調(diào)控多種mRNA，且存在一定的細(xì)胞特異性。人類細(xì)胞中僅存在幾百個(gè)miRNA，且高度保守并具有時(shí)序性，而其具體作用機(jī)制目前仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-187*在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)miR-187*表達(dá)量可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性，并使結(jié)腸癌細(xì)胞周期停滯[8]。而miRNA-125a、miRNA-10、miRNA-155等均被研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤的形成和發(fā)展相關(guān)。本研究針對(duì)的miRNA-7是新近發(fā)現(xiàn)的眾多miRNA 中的一種，其抑制腫瘤增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制已在某些腫瘤中被證實(shí)。在研究宮頸癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，miRNA-7可以通過下調(diào)XIAP的表達(dá)來抑制癌細(xì)胞的增殖活力，并促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。此外在胃癌、乳腺癌及肝癌中miRNA-7 均可發(fā)揮一定的抑癌作用[4-6]。

在鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中miRNA-7是否可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生呢？本研究通過體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將miRNA-7模擬物導(dǎo)入鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中進(jìn)行研究。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在90%左右，而real-time PCR結(jié)果提示轉(zhuǎn)染后miRNA-7的表達(dá)量的確上調(diào)了近百倍余，表明轉(zhuǎn)染后miRNA-7在細(xì)胞內(nèi)可呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，這為miRNA-7在短期內(nèi)發(fā)揮其強(qiáng)效生物學(xué)活性作用提供了有利支持。轉(zhuǎn)染48 h后，利用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-7組的鼻咽癌CNE-1細(xì)胞活力與NC組和Mock組相比明顯受抑制，這表明過表達(dá)的miRNA-7可以在體外顯著抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的活力。

Hanahan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究采用Hoechst 33258染色法對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行觀察分析，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miRNA-7組的細(xì)胞核在熒光顯微鏡下可看到較多的典型細(xì)胞凋亡特征：細(xì)胞核固縮，呈致密濃染，核破碎，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀，而NC組和Mock組的細(xì)胞核在熒光下呈淡藍(lán)色熒光，大小呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均一，未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡特征。這表明體外過表達(dá)miRNA-7可以顯著促進(jìn)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生和進(jìn)展。Bax及Bcl-2作為細(xì)胞內(nèi)最重要的凋亡調(diào)控點(diǎn)之一，兩者的相對(duì)比例是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程發(fā)生的關(guān)鍵因素[11]。因此，為進(jìn)一步探索miRNA-7促鼻咽癌CNE-1細(xì)胞發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，本研究應(yīng)用real-time PCR和Western blot法來分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Bax和Bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后，miRNA-7組CNE-1細(xì)胞中Bax mRNA及蛋白與NC組和mock組相比均顯著上調(diào)，而Bcl-2 mRNA及蛋白則顯著下調(diào)。這表明體外過表達(dá)miRNA-7可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax直接的平衡關(guān)系，使Bax上調(diào)處于優(yōu)勢(shì)地位，并使Bcl-2下調(diào)處于劣勢(shì)地位，進(jìn)而打破CNE-1細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，使鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的凋亡過程加速進(jìn)展，最終引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡壞死。

綜上所述，體外過表達(dá)miRNA-7可以顯著抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡壞死，其作用機(jī)制可能與miRNA-7調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax直接的平衡比例關(guān)系有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

miRNA-7-mediated Bax/Bcl-2 expression promotes apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

SUN Dong-xun1, HUANG Dong-dong1, JIN Qiao-zhi2, CHEN Wu-bing2, CAI Zhi-yi2

(1TheFirstHospitalofJiaxing,Jiaxing314000,China;2DepartmentofOtolaryngology,TaizhouMunicipalHospital,Taizhou318000,China.E-mail:caizy008@tom.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the relationship of microRNA-7 (miRNA-7) over-expression and Bax/Bcl-2 expression in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells.METHODS: The CNE-1 cells were transfected with miRNA-7 mimics using Lipofectamine 2000. The expression of miRNA-7 was detected by real-time PCR. CCK-8 assay and Hoechst 33258 staining were used to detect the cell activity and apoptosis. The expression of Bax/Bcl-2 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The expression of miRNA-7 was increased significantly in the CNE-1 cells compared with negative control group and mock group (P<0.01). The activity of CNE-1 cells were extremely decreased after tansfected with miRNA-7 mimics (P<0.01). The typical apoptotic nuclear morphological changes were observed in the CNE-1 cells under the fluorescence microscope with Hoechst 33258 staining. The expression of Bax at mRNA and protein levels was significantly increased compared with the other 2 groups (P<0.01), while the Bcl-2 expression at mRNA and protein levels was significantly down-regulated (P<0.01).CONCLUSION: Over-expression of miRNA-7 significantly inhibits the growth and promotes the apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells by increasing the expression of Bax and down-regulating Bcl-2.

[KEY WORDS]MicroRNA-7; Bax; Bcl-2; Nasopharyngeal carcinoma; Apoptosis

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0933- 05

[收稿日期]2015- 03- 20[修回日期] 2016- 03- 21

*[基金項(xiàng)目]浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(No. 2013KYB293)

通訊作者△Tel: 0576-88858023； E-mail: caizy008@tom.com

[中圖分類號(hào)]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.028

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