靳彩玲，　趙樹鵬，　張清琴，　王　穎，　寇小格，　路　平△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1腫瘤科， 2神經(jīng)外科，河南 衛(wèi)輝 453100)

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低毒性磁性納米顆粒搭載喜樹堿的抗肺癌作用*

靳彩玲1，趙樹鵬2，張清琴1，王穎1，寇小格1，路平1△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1腫瘤科，2神經(jīng)外科，河南 衛(wèi)輝 453100)

[摘要]目的： 研究磁性納米材料搭載喜樹堿(MNC-Camp)的制備、藥物釋放、細(xì)胞吸收及抗肺癌作用。方法: 紫外分光光度法監(jiān)測MNC-Camp的藥物釋放能力，普魯蘭染色法檢測A549肺癌細(xì)胞對磁性納米材料的吸收能力的影響，利用MTT法測定游離Camp和MNC-Camp對A549細(xì)胞株和白細(xì)胞生長的抑制能力，細(xì)胞侵襲法分析游離Camp和MNC-Camp對A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，酶標(biāo)儀吸光度法檢測細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3的活性。結(jié)果: MNC-Camp的藥物釋放隨著時間的增加而增加，A549肺癌細(xì)胞對磁性納米材料具有良好的吸收能力；與MNC組比較，游離Camp和MNC-Camp能夠使A549細(xì)胞生長能力降低，IC50分別為(35.14±3.21)和(7.16±2.54)mg/L，且A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的數(shù)目下降，凋亡蛋白caspase-3活性增加，以上作用效果MNC-Camp明顯強于游離Camp(P<0.05)。結(jié)論: 磁性納米材料搭載喜樹堿比游離的喜樹堿更能顯著降低人肺癌A549細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力，提示磁性納米材料能增強喜樹堿的抗肺癌作用。

[關(guān)鍵詞]磁性納米材料； 喜樹堿； A549細(xì)胞； Caspase-3

喜樹堿(camptothecin，Camp)是從喜樹中提取出來的一種生物堿[1]，Wall等最早發(fā)現(xiàn)喜樹果實提取物對小鼠肺癌Ad-755有一定的抑制作用，喜樹堿系列衍生物抗癌藥物是附加值極高的高技術(shù)產(chǎn)品[2-4]，但對患者的正常細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，比如會導(dǎo)致白細(xì)胞的減少。為了增加藥物對腫瘤細(xì)胞的特異性治療，藥物特異性載體技術(shù)的應(yīng)用在化療中受到廣泛關(guān)注[5]。磁性納米材料作為納米材料的一種，具有磁靶向藥物傳遞的獨特性能[6]，其主要原理是以復(fù)合磁性顆粒作為藥物載體，在磁場的作用下，產(chǎn)生熱能且磁性載藥微粒會大量的富集于患者的病變部位并受控釋放，進(jìn)而對病變部位進(jìn)行局部熱療和針對性藥物治療[7-8]。肺癌是惡性化程度最高的惡性腫瘤之一，利用靶向的多功能磁性納米載體作為新型化療藥物載體的治療具有重要的臨床意義。本文主要探討裝載Camp的磁性納米載體的抗肺癌效應(yīng)，觀察其在抑制腫瘤生長的臨床應(yīng)用中的潛力。

材料和方法

1實驗材料

人肺癌細(xì)胞A549和人白細(xì)胞購自ATCC(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物種保藏委員會細(xì)胞庫 /中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，在本實驗室進(jìn)行培養(yǎng)。

喜樹堿、Caspase-Glo?3檢測試劑盒購自Sigma；MPEG-PLGA、Fe3O4、DMSO(阿拉丁試劑有限公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)基(Thermo)；優(yōu)級胎牛/小牛血清(PAA)；胰蛋白酶(Gibco)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2實驗方法

2.1磁性納米藥物的制備[9]首先將10 mg MPEG-PLGA共聚物、2 mg Camp和2 mg Fe3O4納米粒子溶于2 mL 四氫呋喃 (tetrahydrofuran, THF)和 DMSO的混合溶劑(1∶1)中。在超聲條件下將上述混合溶液逐滴加至10 mL的超純水中，進(jìn)行透析以形成膠束，所得膠束溶液用微孔濾膜過濾除去Camp和Fe3O4納米粒子聚集物。通過紅外顯微鏡證實藥物Camp成功裝載，并命名為MNC-Camp。用同樣的方法制備不含Camp的空白微球，通過透射電鏡觀察微球形態(tài)。

2.2磁性納米載體藥物的釋放和細(xì)胞吸收[10]藥物釋放研究是在37 ℃、磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)的環(huán)境中進(jìn)行。將納米裝載Camp(50 mg/L)的膠束溶液加入透析袋中。然后將透析袋置于80 mL的緩沖介質(zhì)中，37 ℃條件下緩慢振蕩。在選定的時點(12 h)，從透析袋中取出樣品，溶于DMSO， 12 000 r/min 離心30 min除去Fe3O4納米粒子，用紫外分光光度法分析測定剩余Camp的含量。從最初的Camp量中扣除透析袋中剩余的 Camp含量，即可計算得到藥物的釋放量。將A549細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)。然后加入濃度為 400 mg/L磁性納米載體，培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)基吸出，加入4%多聚甲醛溶液(4 ℃固定細(xì)胞 30 min)，在加入4%多聚甲醛溶液前后，每孔用 PBS 各洗2遍，PBS洗完后，加入5%亞鐵氰化鉀和5% HCl 的混合物(1∶1)，并在室溫下培養(yǎng) 1 h，再用中性紅復(fù)染色后用PBS洗3遍，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.3MTT法檢測細(xì)胞的生長抑制[11]將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞和白細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化單細(xì)胞，重懸于新鮮生長培養(yǎng)液中；細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板；置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；根據(jù)實驗設(shè)計，處理96孔板中的細(xì)胞，繼續(xù)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，藥物處理6 h、12 h、24 h后，直接于每孔中加入(50 mg/L)MTT溶液，37 ℃孵育2～4 h；室溫靜置至沉淀完全溶解(10 min)，用酶標(biāo)儀(檢測波長570 nm)檢測各孔吸光度(A)值。取復(fù)孔平均值計算細(xì)胞死亡率。

2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察將A549細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期后加入游離Camp和MNC-Camp(50 mg/L)，用細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化情況。

2.5凋亡蛋白caspase 3活性的檢測[12]采用 Caspase-GlooR3檢測試劑盒，具體過程參照產(chǎn)品說明書。分析前將試劑與96孔板置于室溫平衡，之后將A549細(xì)胞以每孔1.5×104的數(shù)量接種于96孔板，選取不同濃度的游離Camp和MNC-Camp處理 6 h、12 h、24 h 后，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加等體積(1∶1)的Caspase-Glo試劑，置于振蕩儀，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速輕輕振蕩混合30 s，室溫孵育60 min后，用酶標(biāo)儀檢測，并與MNC組進(jìn)行對比。

2.6細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的檢測[13]將Transwell 小室的濾膜內(nèi)表面涂細(xì)胞外基質(zhì)膠(每室50 μg)。小室干燥后重新加入含有0.1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基水化(在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力實驗時無需進(jìn)行外基質(zhì)膠的涂層和水化)。在Transwell 小室的下室中加入新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配制成(50 mg/L)細(xì)胞懸液，每孔250 μL，接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的環(huán)境下孵化24 h，待細(xì)胞完全貼壁生長后將細(xì)胞分為MNC組、游離Camp組和MNC-Camp組，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)16 h。取出小室后，使用PBS溶液沖洗濾膜，使用PBS棉棒吸除和擦除上室的細(xì)胞，再根據(jù)Transwell小室使用說明進(jìn)行染色觀察，計算穿膜的細(xì)胞數(shù)，從而反映各組細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。實驗為3次重復(fù)實驗。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，事后多重比較采用SNK-q檢驗；以 P<0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1磁性納米微球的形態(tài)和粒徑

圖1所示磁性納米微球的外觀呈圓形，分布均勻，不粘連。磁性微球中可見均勻分散的黑色不透光區(qū)，為Fe3O4微粒。激光粒度分析儀測定粒徑分布范圍，粒度集中分布在600～1 500 nm，平均粒徑為960 nm。

Figure 1.Transmission electronic microscopic image of the MNC (×1 000).

圖1透射電鏡觀察MNC

2體外藥物釋放研究

如圖2所示，藥物釋放隨著時間的變化增加而增加，在30 h處形成拐點，是一種典型的兩階段釋放曲線,即在第 1 階段(0～30 h)相對快速釋放后，有一個持續(xù)到100 h的持續(xù)緩慢釋放階段。

3磁性納米載體的細(xì)胞吸收

大量藍(lán)色的點(鐵)位于細(xì)胞膜周圍并貫穿細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞中，而對照細(xì)胞中沒有出現(xiàn)任何的藍(lán)點，見圖3。

4人肺癌A549細(xì)胞和白細(xì)胞生長能力檢測

游離Camp組和MNC-Camp組作用A549細(xì)胞后，與MNC組相比，A549細(xì)胞生長抑制率都呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與0 h相比，游離Camp組和MNC-Camp組的A549細(xì)胞生長抑制率呈時間依賴性增加(P<0.05)；同濃度下的MNC-Camp對A549細(xì)胞的生長抑制效果明顯優(yōu)于游離Camp組，24 h的半數(shù)抑制濃度分別為(7.16±2.54)和(35.14±3.21)mg/L，見表1；圖4顯示MNC-Camp對白細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)低于游離Camp(P<0.05)。

Figure 2.The release profiles of Camp from MNCinvitro. Mean±SD. n=3.

圖2磁性納米載體中喜樹堿釋放的體外研究

Figure 3.The micrographs of magnetic nanoparticle carrier absorbed by the cells (HE staining, ×1 000).

圖3磁性納米載體被細(xì)胞吸收的顯微圖像

表1　各組人肺癌A549細(xì)胞生長抑制率

*P<0.05 vs MNC group;#P<0.05 vs free Camp group;△P<0.05 vs 0 h.

Figure 4.Toxicology test of the white blood cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs free Camp group.

圖4白細(xì)胞毒理學(xué)試驗

5人肺癌A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

形態(tài)學(xué)觀察可見在游離Camp和MNC-Camp作用下，與MNC組相比，A549細(xì)胞的生長抑制作用明顯，具體表現(xiàn)為細(xì)胞不貼壁，逐漸變?yōu)閳A形，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞固縮，呈現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象，見圖5。

6細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的檢測

從表2中看出，與MNC組相比，隨著游離Camp組和MNC-Camp組藥物濃度的增大，穿膜的人肺癌A549細(xì)胞數(shù)目顯著地減少(P<0.05)，且MNC-Camp組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于游離Camp組(P<0.05)。

7人肺癌A549細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3活性檢測

與MNC組比較，游離Camp組和MNC-Camp組在作用6 h、12 h、24 h后caspase-3的活性增加顯著(P<0.05)；與0 h相比，游離Camp組和MNC-Camp組的caspase-3活性隨著作用時間的增加呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(P<0.05)；且MNC-Camp組的caspase-3活性明顯高于游離Camp組(P<0.05)，見表2。

Figure 5.The morphological observation of human lung cancer A549 cells (×400).

圖5人肺癌A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

表2　各組細(xì)胞的侵襲能力和caspase-3活性

*P<0.05 vs MNC group;#P<0.05 vs free Camp group;△P<0.05 vs 0 h group.

討論

喜樹堿是從我國特有的珙桐科植物喜樹中提取分離的天然生物堿，是一類廣譜的抗腫瘤藥，尤其在消化道腫瘤中的應(yīng)用更多。但近年來國內(nèi)外大量研究表明，喜樹堿能夠誘導(dǎo)乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，這是由于喜樹堿可選擇性抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，從而起到抗腫瘤效應(yīng)。對于晚期肺癌患者，傳統(tǒng)的化療藥物存在明顯的療效-劑量依賴關(guān)系，常規(guī)治療劑量大，在殺傷腫瘤組織的同時會對正常組織器官產(chǎn)生顯著的毒副作用，缺乏組織選擇性[14]。而以納米技術(shù)為基礎(chǔ)的藥物化療應(yīng)用的不斷發(fā)展，局部藥物緩慢釋放、靶向運輸、提高特異性療效的同時降低毒副作用越來越變得有可能。在已報道的各類磁性納米材料中，由于Fe3O4納米粒子制備工藝簡單、價格低廉、飽和磁化強度高等特點，同時又對人體不產(chǎn)生毒副作用，無免疫原性，可隨人體代謝排除體外，易穿過各種生理屏障到達(dá)指定部位，因此，在免疫檢測和藥物靶向等方面具有無可比擬的優(yōu)勢。

本實驗對磁性Fe3O4納米粒子材料裝載喜樹堿抑制人肺癌A549細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的能力進(jìn)行了評估，我們發(fā)現(xiàn)磁性納米材料具有穩(wěn)定和良好的藥物釋放，且對A549細(xì)胞有很好的靶向和細(xì)胞吸收能力。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，游離Camp組和MNC-Camp組都能夠?qū)549細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞穿過人工基底膜的能力下降，很好阻礙了A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；但MNC-Camp組的作用明顯優(yōu)于游離Camp，具有更好的靶向細(xì)胞吸收能力，能夠快速作用于A549細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生良好的效果。

此外，在A549細(xì)胞凋亡過程中，酶聯(lián)反應(yīng)的終末因子是由caspase-3和caspase-9共同組成的[15-16]。Caspase-3是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，在實驗過程中caspase-3能夠催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA(405 nm)；我們的實驗結(jié)果顯示經(jīng)過游離Camp和MNC-Camp處理后，caspase-3活性不斷增加，而且呈時間和劑量依賴性，這意味著游離Camp和MNC-Camp還能夠?qū)aspase-3產(chǎn)生激活作用，進(jìn)而對酶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行有效的調(diào)控；最終對A549細(xì)胞生長起到抑制作用，研究還發(fā)現(xiàn)MNC-Camp的抑制能力明顯優(yōu)于游離Camp，這是由于其靶向運輸、局部藥物緩慢釋放、提高藥物濃度，繼而能夠增加喜樹堿的特異性療效，這與以往單獨藥物治療相比，抗肺癌療效有了很大的提高，以上實驗結(jié)果說明MNC-Camp具有高效、高特異性和低毒的特點，有臨床應(yīng)用的潛在價值。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Anti-lung cancer efficacy of magnetic nanoscale carrier with camptothecin

JIN Cai-ling1, ZHAO Shu-peng2, ZHANG Qing-qin1, WANG Ying1, KOU Xiao-ge1, LU Ping1

(1Department of Medical Oncology，2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, China. E-mail: 2743849621@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the preparation, drug release, cell absorption and anti-lung cancer efficacy of magnetic nanoscale carrier with camptothecin (MNC-Camp). METHODS: The drug release ability of MNC-Camp was detected by ultraviolet spectrophotometric method. Absorption of magnetic nanoparticles by A549 cells was measured by pullulan staining method. The growth inhibition ability of Camp and MNC-Camp on the A549 cells and white blood cells was analyzed by MTT assay. The metastasis ability of A549 cells treated with Camp and MNC-Cmap was evaluated by cell invasion method. The activity of apoptosis protein caspase-3 was detected by ELISA. RESULTS: A549 cells had a good absorption ability on MNC, and the drug release of MNC-Camp increased with time increasing. Compared with MNC group, Camp and MNC-Camp induced the apoptosis of A549 cells, and the half inhibition concentration (IC50) were (35.14±3.21) and (7.16±2.54) mg/L, respectively.Camp and MNC-Camp also decreased the A549 cell transfer number and increased the activity of apoptosis protein caspase-3. All the effects of MNC-Camp were obviously significant than those of free Camp (P<0.05). CONCLUSION: MNC-Camp has a better inhibitory effect on the growth of A549 cells than free Camp, and finally plays an important role in anti-lung cancer effect.

[KEY WORDS]Magnetic nanomaterials; Camptothecin; A549 cells; Caspase-3

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0928- 05

[收稿日期]2016- 01- 06[修回日期] 2016- 03- 23

*[基金項目]河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃(No. 2011020091)

通訊作者△Tel： 0373-4402543； E-mail： 2743849621@qq.com

[中圖分類號]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.027

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net