王婧薷，　陳苑雯，　李　朦，　李升紅，　廖　選，　張志丹，　謝光輝，　劉宏偉△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院整形外科， 2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，廣東 廣州 510632)

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脂肪源性血管基質(zhì)成分對皮膚光老化的影響*

王婧薷1,2，陳苑雯1,2，李朦1,2，李升紅1，廖選1，張志丹1，謝光輝1，劉宏偉1,2△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院整形外科，2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 觀察人脂肪源性血管基質(zhì)成分 (stromal vascular fractions, SVF) 對中波紫外線(ultraviolet B, UVB) 誘導(dǎo)的裸大鼠皮膚光老化的影響。方法: 6周齡裸大鼠隨機(jī)分為正常對照組及實驗組，實驗組持續(xù)UVB照射8周建立皮膚光老化模型并隨機(jī)分為模型組，以及SVF低劑量 (low-dose, LD)、中劑量(middle-dose, MD) 和高劑量 (high-dose, HD) (100 μL懸液中的細(xì)胞數(shù)分別為104、105和106) 治療組；采用酶消化法提取健康女性脂肪組織中的SVF，分別取低、中、高劑量的SVF懸液注射于裸大鼠背部皮下；模型組注射相同劑量的生理鹽水，正常對照組不做任何處理；7 d后取材，觀察注射部位表皮厚度及結(jié)構(gòu)的改變；28 d后取材觀察注射部位真皮厚度及結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果: SVF治療7 d后，中、高劑量治療組裸大鼠皮膚較實驗對照組表皮層厚度減小、角質(zhì)層比例下降、基底層處于異常增殖狀態(tài)的細(xì)胞核減少(P<0.05)。治療28 d后，中劑量及高劑量治療組I型膠原蛋白mRNA相對表達(dá)量增加，III型膠原蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-3 (matrix metalloproteinases-3, MMP-3) mRNA相對表達(dá)量下降(P<0.05)，高劑量治療組皮膚真皮層厚度增加(P<0.05)。結(jié)論: SVF具有抗皮膚光老化的潛能，有潛在的臨床應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞]血管基質(zhì)成分； 脂肪源性干細(xì)胞； 光老化

皮膚作為人體最大的器官，其衰老是機(jī)體衰老最直觀的表現(xiàn)形式。皮膚老化是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，受內(nèi)源性(遺傳、心理等)及外源性因素的影響[1]。在這些因素的共同作用下，皮膚的結(jié)構(gòu)、功能及外觀均發(fā)生了改變。

日光中所含的紫外線(ultra violet, UV)照射(光老化)是外源性皮膚老化的關(guān)鍵因素，其中中波紫外線(ultra violet B, UVB) 被認(rèn)為對皮膚皺紋的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用[2]。長期接觸UV的皮膚表現(xiàn)為粗糙、皺紋深亂、失去彈性，而膠原纖維作為人體皮膚的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是維持皮膚張力及飽滿充盈的基礎(chǔ)。在成年人皮膚中，I型膠原約占皮膚膠原含量的80%，III型膠原約占10%～15%，日光照射可影響I型膠原蛋白的形成，使幼稚的III型膠原含量相對增加，最終導(dǎo)致成熟的膠原束減少，造成皮膚的老化、松弛[3]。UV照射還可刺激真皮炎癥反應(yīng)，激活血管周圍的炎性遞質(zhì)及細(xì)胞因子，導(dǎo)致溶解酶的產(chǎn)生，從而緩慢溶解真皮成分[4]，細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)或反復(fù)的蛋白酶解是皮膚光老化過程的基本特質(zhì)之一，細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡造成真皮不完全修復(fù)也是皮膚皺紋形成的重要原因[5]，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)家族的協(xié)同作用對細(xì)胞外基質(zhì)的降解起了重要作用，又以基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)及基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3, MMP-3)最為主要。光老化的組織學(xué)改變除了表現(xiàn)在真皮層外，同樣存在表皮的改變，包括角化過度、表皮層的不規(guī)則增厚或萎縮、基底層細(xì)胞的異常增殖等[4]。

細(xì)胞治療是現(xiàn)有醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿治療方式，干細(xì)胞用于創(chuàng)面愈合及腫瘤等的治療已得到研究及應(yīng)用，而將其用于抗衰老的研究仍然有限。2001年，Zuk等[6]在抽脂術(shù)所獲得的脂肪組織中證實存在一群間充質(zhì)來源的成體干細(xì)胞——脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)后，已有相關(guān)文獻(xiàn)證實ADSCs可通過旁分泌和自分泌作用促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、分泌及遷移，同時促進(jìn)血管再生以參與皮膚組織損傷的修復(fù)和結(jié)構(gòu)重建[7-10]，以往的研究也已提出ADSCs可通過抗氧化、激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其分泌膠原蛋白等途徑改善老化的皮膚[11-12]。血管基質(zhì)成分(stromal vascular fractions，SVF)是一組含豐富ADSCs的混合細(xì)胞群，ADSCs的含量在20%～30%[13]，同時還含有血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、周細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，而現(xiàn)少有文獻(xiàn)對SVF對光老化皮膚的影響進(jìn)行報道。本課題組通過UVB誘導(dǎo)裸大鼠皮膚光老化模型，將SVF皮下注射用于皮膚光老化的治療，觀察SVF對光老化皮膚的影響。

材料和方法

1一般資料

脂肪組織(來源于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科抽脂的健康年輕女性6人，年齡在28～34歲，已獲得病人的知情同意)；裸大鼠[雌性，15只，6周齡，體重100 g±5 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK(京)202012-0001]。

2主要方法

2.1SVF的提取利用脂肪抽吸技術(shù)抽取健康成年女性大腿或腹部皮下脂肪組織，去除纖維結(jié)締組織成分，置于離心管內(nèi)，用PBS緩沖液清洗2～3次，加入等體積1% I型膠原酶，37 ℃環(huán)境振蕩消化30 min，300×g離心10 min，加入完全培養(yǎng)基(DMEM + 10%FBS + 1%雙抗)終止消化，使用200目篩網(wǎng)過濾后300×g離心10 min，所得沉淀即為SVF[14]。運用流式細(xì)胞術(shù)鑒定SVF中ADSCs含量，鑒定表面標(biāo)志物,包括CD105、CD59、CD44、CD45、CD34、CD29和HLA-DR。

2.2SVF中ADSCs的體外培養(yǎng)前述方法提取SVF后，采用完全培養(yǎng)基重懸SVF，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，此為原代細(xì)胞(P0)，于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d換液，待細(xì)胞長至80%～90%融合時，按1∶3的比例進(jìn)行傳代。取P3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定及成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)。

2.3動物分組及裸大鼠皮膚光老化模型建立15只6周齡裸大鼠飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實驗動物管理中心，在SPF環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、SVF低劑量治療組、SVF中劑量治療組及SVF高劑量治療組。除正常對照組外，其余實驗組采用自制UVB照射燈箱(UVB燈管波長290～320 nm，15 W，2只，燈箱高度50 cm)照射，裸大鼠可在燈箱內(nèi)自由活動。照射方式[15]：第1周60 mJ/cm2，第2周120 mJ/cm2，第3周180 mJ /cm2，第4～8周240 mJ/cm2，每周5次，共8周，總照射劑量為7.8 J/cm2。

2.4注射方式的選取取SD大鼠3只，背部脫毛處理，1 mL注射器皮下注射美藍(lán)溶液100 μL，觀察美藍(lán)溶液的擴(kuò)散范圍并做測量。

2.5細(xì)胞注射注射前3 d停止UVB輻照，根據(jù)方法2.4中注射方式及劑量的探索，使用10%水合氯醛麻醉裸大鼠后于其背部皮膚皮下注射100 μL SVF。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[9-10]，各組細(xì)胞含量分別為：SVF低劑量(low-dose, LD)組：104；中劑量(middle-dose, MD)組：105；高劑量組(high-dose, HD)組：106。模型組和正常對照組注射等劑量生理鹽水。分別于注射后7 d及28 d后使用皮膚取樣器鉆取6 mm直徑組織，4%多聚甲醛固定用于制作石蠟切片。28d后處死所有動物，取剩余皮膚組織凍存于液氮罐內(nèi)備用。

2.6HE染色皮膚樣品于4%多聚甲醛固定48 h，脫水透明后進(jìn)行石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片(4 μm)，黏附于多聚賴氨酸處理過的玻片上。取各組石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木精染液及0.5%伊紅溶液染色，梯度乙醇脫水后中性樹膠封片。倒置相差顯微鏡下拍照，ImageJ軟件測量真表皮厚度。

2.7Real-time PCR測定I型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白及MMP-3 mRNA相對表達(dá)水平取保存在液氮中的皮膚組織50 mg，提取樣本皮膚組織的總RNA，并使用1%凝膠電泳檢測所提取總RNA的質(zhì)量，測定濃度并定量后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo)完成逆轉(zhuǎn)錄。取逆轉(zhuǎn)錄后cDNA使用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行PCR檢測。引物設(shè)計：內(nèi)參照β-actin上游引物為5’-GAGTACAACCTTCTTGCAGCTC-3’, 下游引物為5’-CATACCCACCATCACACCCTG-3’，擴(kuò)增長度198 bp;collagenⅠ上游引物為5’-GATGGACTCAACGGTCTCCC-3’,下游引物為5’-CGGCCACCATCTTGAGACTT-3’，擴(kuò)增長度143 bp；collagenⅢ上游引物為5’-CTGAAGGGCAGGGAACAACT-3’,下游引物為5’-ATCCCGAGTCGCAGACACATA-3’，擴(kuò)增長度270 bp；MMP-3上游引物為F:5’-CAGGCATTGGCACAAAGGTG-3’,下游引物為5’-CTGAAACACACGACGCCTTC-3’，擴(kuò)增長度174 bp。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算。

2.8免疫組化取7 d的皮膚樣本石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，置于檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，移入微波爐進(jìn)行微波抗原修復(fù)10 min；自然冷卻至室溫后0.3% Triton X-100室溫孵育15 min；3% H2O2浸泡20 min去除內(nèi)源性過氧化氫酶；滴加山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，滴加兔抗大鼠Ki67多克?、窨箍贵w工作液(Abcam，1∶100稀釋)，4 ℃冰箱過夜；第2天取出PBS浸洗后滴加山羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育30 min，DAB顯色劑顯色；蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈棕黃色為陽性染色；每張切片隨機(jī)選取10個高倍鏡(×400)視野，測定每個視野下陽性細(xì)胞的陽性率。

3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)采用完全隨機(jī)設(shè)計資料的方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1SVF流式細(xì)胞儀標(biāo)記鑒定

正常人脂肪組織提取SVF所含ADSCs百分比為25.79%±5.70%。

2SVF中所含ADSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

原代培養(yǎng)的ADSCs在貼壁后充分伸展，呈長梭形，單個或集落樣生長。流式細(xì)胞儀標(biāo)記表面標(biāo)記物顯示CD29、CD59、CD44和CD105陽性表達(dá)，陽性率分別為86.13%、97.14%、99.56%和66.95%；CD34、CD45和HLA-DR陰性表達(dá)，表達(dá)率分別為5.36%、2.70%和3.01%。取P3代細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后油紅O染色，在顯微鏡下可見油滴狀脂肪組織；經(jīng)成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色，可見聚成團(tuán)的骨組織被染成紅色；經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后阿新藍(lán)染色，可在顯微鏡下觀察到成塊狀的軟骨組織被染成淺藍(lán)色。說明本實驗組所獲得細(xì)胞為ADSCs，見圖1。

3皮下注射美藍(lán)溶液的擴(kuò)散范圍

大鼠皮下注射100 μL美藍(lán)溶液后可見注射液向周邊組織擴(kuò)散，呈直徑約1.5 cm大小類圓形。

4經(jīng)SVF治療后裸大鼠皮膚表皮厚度及角質(zhì)層的改變

HE染色可見，經(jīng)UVB照射后皮膚表皮層全層明顯增厚，且角質(zhì)層在表皮中所占比例明顯增加，經(jīng)SVF治療后，前述指標(biāo)均有改變。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，治療后7 d，中、高劑量組表皮厚度較對照組減小(P<0.05)，表皮角質(zhì)層比例降低(P<0.05),說明中、高劑量的SVF可減少光老化皮膚表皮層厚度及角質(zhì)層所占的比例，見圖2。

Figure 1.Multilineage differentiation potential of adipose-derived stem cells (ADSCs)(×100). A: ADSCs in vitro; B: Oil Red O staining; C: Alizarin red staining; D: Alcian blue staining.

圖1脂肪源性干細(xì)胞多分化潛能鑒定

Figure 2.HE staining showed the changes of epidermal thickness of nude rats exposed to UVB 7 d after SVF treatment (×400).Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs UVB(-) group;△P<0.05 vs UVB(+) group.

圖2HE染色顯示UVB誘導(dǎo)皮膚光老化裸大鼠經(jīng)SVF治療7 d后表皮的變化

5表皮基底層細(xì)胞核增殖情況分析

UVB照射后，表皮基底細(xì)胞層處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞核明顯增多，基底層細(xì)胞排列紊亂，經(jīng)SVF治療后，可見各組基底層細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞核明顯減少。治療7 d后，SVF各劑量組表皮基底層處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞核均有減少(P<0.05),說明各劑量組SVF可有效抑制UVB照射引起的基底層細(xì)胞的異常增殖，見圖3。

6經(jīng)SVF治療后真皮厚度的改變

治療7 d后各劑量組真皮厚度均無明顯改變，此部分陰性數(shù)據(jù)未給出。HE染色可見，經(jīng)UVB照射后皮膚真皮層變薄，治療28 d后SVF高劑量治療組真皮厚度增加(P<0.05),說明高劑量的SVF可增加光老化皮膚真皮厚度，見圖4。

Figure 3.Ki67 immunostaining showed the proliferation of basal cells of nude rats exposed to UVB and 7 d after SVF treatment (×400). Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs UVB(-) group;△P<0.05 vs UVB(+) group.

圖3Ki67免疫組織化學(xué)染色顯示SVF對UVB誘導(dǎo)皮膚光老化裸大鼠表皮基底層細(xì)胞核增殖能力的影響

Figure 4.HE staining showed the changes of dermal thickness of nude rats exposed to UVB 28 d after SVF treatment (×40). Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs UVB(-) group；△P<0.05 vs UVB(+) group.

圖4HE染色顯示UVB誘導(dǎo)皮膚光老化裸大鼠經(jīng)SVF治療28 d后真皮層的變化

7真皮內(nèi)I型膠原蛋白、III型膠原蛋白及MMP-3 mRNA相對表達(dá)量的改變

治療7 d后各劑量組I、III型膠原蛋白及MMP-3 mRNA相對表達(dá)量無明顯改變，此部分陰性數(shù)據(jù)未給出。治療28 d后，SVF各治療組真皮內(nèi)I型膠原蛋白濃度增加，III型膠原蛋白濃度下降，中、高劑量組膠原蛋白mRNA相對表達(dá)量改變有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；參與膠原蛋白降解的MMP-3 mRNA相對表達(dá)量減少，僅高劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明中、高劑量的SVF可上調(diào)I型膠原蛋白mRNA相對表達(dá)量，下調(diào)III型膠原蛋白mRNA的表達(dá),高劑量的SVF可下調(diào)MMP-3 mRNA的表達(dá)，見圖5～7。

Figure 5.Real-time PCR showed the relative mRNA expression of collagen I of nude rats exposed to UVB 28 d after SVF treatment. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs UVB(-) group；△P<0.05 vs UVB(+) group.

圖5Real-time PCR測定UVB誘導(dǎo)皮膚光老化裸大鼠經(jīng)SVF治療后28 d皮膚I型膠原蛋白mRNA的相對表達(dá)量

討論

細(xì)胞治療作為一種全新的治療方式，已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要方向。干細(xì)胞可通過不斷的分化及自我修復(fù)達(dá)到組織再生與修復(fù)的目的，胚胎干細(xì)胞曾被認(rèn)為是最好的干細(xì)胞來源，然而胚胎干細(xì)胞在應(yīng)用中存在的倫理問題及其潛在的致癌可能阻礙了它的臨床應(yīng)用。成體干細(xì)胞源于發(fā)育過程完成之后，同時又具有分化潛能而越來越受到關(guān)注。近年來，基于SVF用于促進(jìn)傷口愈合、組織修復(fù)、外周性血管疾病等的相關(guān)報道日益增多[16-17]，而少有其對皮膚光老化影響的報道。SVF廣泛存在于皮下脂肪組織中，通過簡單的脂肪抽吸手術(shù)即可大量獲得，病人承受的痛苦小，臨床可實現(xiàn)即取即用；同時其利用過程無外源性物質(zhì)的接觸，規(guī)避了細(xì)胞治療中可能存在的生物安全性問題，降低了感染的風(fēng)險。經(jīng)我們的實驗發(fā)現(xiàn)，SVF能有效改善光老化引起的皮膚表皮層及表皮角質(zhì)層增厚，基底層細(xì)胞核異常增殖，真皮層變薄等老化現(xiàn)象，具有抗皮膚光老化的潛能。

Figure 6.Real-time PCR showed the relative mRNA expression of collagen III of nude rats exposed to UVB 28 d after SVF treatment. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs UVB(-) group；△P<0.05 vs UVB(+) group.

圖6Real-time PCR測定UVB誘導(dǎo)皮膚光老化裸大鼠經(jīng)SVF治療后28 d皮膚III型膠原蛋白mRNA的相對表達(dá)量

Figure 7.Real-time PCR showed the relative mRNA expression of MMP-3 of nude rats exposed to UVB 28 d after SVF treatment. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs UVB(-) group；△P<0.05 vs UVB(+) group.

圖7Real-time PCR測定UVB誘導(dǎo)皮膚光老化裸大鼠經(jīng)SVF治療后28 d皮膚MMP-3 mRNA的相對表達(dá)量

正常皮膚表皮更新一次大約需要28 d，但在發(fā)生異物入侵和角質(zhì)層遭到破壞時，基底細(xì)胞分裂變得旺盛，加快更新的速度，藉以排除異物和修復(fù)；在皮膚受到化學(xué)(有機(jī)溶劑等)或物理(UVB等)刺激時，可引起表皮增生及異常角化[18]，出現(xiàn)角質(zhì)層的異常增厚。在我們的實驗中，UVB照射后的裸大鼠表皮組織明顯增厚，這一現(xiàn)象同時發(fā)生在表皮的生發(fā)層與角質(zhì)層中，且角質(zhì)層細(xì)胞所占比例明顯增加；同時可見UVB照射后表皮基底層細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，UV誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的DNA損傷在沒有被修復(fù)的情況下可致細(xì)胞異常增殖[19-20]。UV輻射誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖途徑是細(xì)胞對抗凋亡的適應(yīng)性過程，Ki67是一種增進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，對DNA合成的調(diào)節(jié)起重要作用[22]。在SVF及皮下注射后，表皮基底層處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞明顯減少，這一效果在SVF達(dá)到105、106細(xì)胞(100μL)時非常明顯，其處于增殖期的細(xì)胞核基本與正常皮膚組織相同，這說明SVF對表皮抗UV損傷具有重要的調(diào)節(jié)作用，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。我們認(rèn)為這可能通過2種途徑對抗UV引起的表皮損傷從而改善增厚的表皮組織：(1)有效抑制基底層細(xì)胞的異常過度增殖，從而有效抑制表皮細(xì)胞的過度角化；(2)通過調(diào)節(jié)作用，加速表皮組織細(xì)胞的角化及更新的速度，促進(jìn)表皮細(xì)胞更新，使表皮組織重新恢復(fù)平衡狀態(tài)。

皮膚光老化的改善與創(chuàng)面愈合都是皮膚的修復(fù)過程，其機(jī)制存在著一定的共性。已有研究報道成體干細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及新生血管的形成，促進(jìn)肉芽組織的生長及上皮化，從而達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的目的[7-8]。在我們的實驗中觀察到SVF皮下注射可增加裸大鼠真皮厚度，促進(jìn)真皮中I型膠原蛋白mRNA表達(dá)，抑制III型膠原蛋白mRNA的表達(dá)，膠原蛋白占人體真皮蛋白含量的約90%，其中主要為I型膠原蛋白(85%～95%)及III型膠原蛋白(10%～15%)[2]，隨著年齡的增加，在身體同一部位皮膚I型膠原蛋白含量減少，III膠原比例增加，這一表現(xiàn)在UVB暴露區(qū)更加明顯[21-22]，膠原蛋白含量的減少及不同成分膠原蛋白比例的改變，使皮膚變得松弛，塌陷，從而形成皺紋[1,23]。中、高劑量組的SVF能有效改善真皮組織中I/III型膠原蛋白的比例，使其更加接近年輕、健康的皮膚組織。ADSCs為SVF的主要細(xì)胞成分，已有文獻(xiàn)報道證實ADSCs可有效增加真皮層厚度及膠原蛋白含量，從而改善了皮膚表面的皺紋[1,18]，其亦可通過促進(jìn)刺激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白修復(fù)真皮組織[9,11,13]。MMPs是一個含鋅的蛋白酶家族，MMPs通過降解細(xì)胞外基質(zhì)引起組織損傷從而導(dǎo)致皺紋的形成[24]。過量的UV照射可以增加角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等對MMPs的分泌，MMP-1、MMP-3和MMP-9可被UV照射誘導(dǎo)分泌，對與皮膚質(zhì)量密切相關(guān)的I型膠原蛋白，MMP-1啟動膠原纖維斷裂程序，MMP-3則進(jìn)一步將其降解[25]，真皮組織中MMP-3含量的多少直接影響了膠原蛋白的降解效率。我們的實驗中觀察到SVF皮下注射有效減少真皮組織中MMP-3 mRNA的相對表達(dá)量，這一作用可能是通過減緩膠原蛋白的降解速率，改善膠原合成與降解的失平衡狀態(tài)，從而增加膠原蛋白含量以改善老化的皮膚。

綜上所述，我們此次的研究通過觀察真、表皮厚度、結(jié)構(gòu)，真皮膠原蛋白及MMP-3 mRNA的相對表達(dá)量，表皮基底層細(xì)胞核增殖能力的變化，在表觀學(xué)、組織學(xué)及mRNA表達(dá)方面證實了SVF改善皮膚光老化的潛能，為SVF在改善皮膚光老化臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Anti-aging effect of stromal vascular fractions in photoaging skin

WANG Jing-ru1, 2, CHEN Yuan-wen1, 2, LI Meng1, 2, LI Sheng-hong1, LIAO Xuan1, ZHANG Zhi-dan1, XIE Guang-hui1, LIU Hong-wei1, 2

(1DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospital,2KeyLaboratoryofMinistryofEducationforRegenerativeMedicine,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:liuhongwei0521@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the anti-aging effect of the stromal vascular fractions (SVF) injection in photo-aging skin of nude rats. METHODS: Six-week-old nude rats were divided into control group and photoaging group. The nude rats in photoaging group were continuously irradiated with ultraviolet B (UVB) for 8 weeks to build the photoaging skin model, and were randomly divided into placebo group, and low-dose (LD), middle-dose (MD) and high-dose (HD) SVF treatment groups. The human SVF was obtained by trypsin digestion from the adipose tissue in healthy females, and was subcutaneously injected into the back skin of photoaging nude rats in LD, MD and HD SVF treatment groups (104,105 and 106 cells in 100 μL suspension, respectively). The animals in photoaging skin model group were treated with placebo. Control group did not have any intervention. The changes in the thickness of epidermis and histology after 7 d and the thickness of the dermis and histology after 28 d were examined. RESULTS: The thickness of the epidermis was thinner in MD and HD SVF treatment groups than that in photoaging skin model group after 7 d (P<0.05). The percentage of stratum corneum and the abnormal proliferation of the epidermal basal cell layer were reduced (P<0.05). After 28 d, MD and HD SVF treatment groups showed that the content of collagen I was higher than that in photoaging skin model group (P<0.05), and the contents of collagen III and MMP3 were decreased (P<0.05). The dermis in HD group was thicker than that in photoaging skin model group (P<0.05).CONCLUSION: SVF may have anti-aging potential in photoaging skin and also has clinical application value.

[KEY WORDS]Stromal vascular fractions; Adipose-derived stem cells; Photoaging

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0892- 08

[收稿日期]2015- 11- 30[修回日期] 2016- 02- 15

*[基金項目]國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃資助項目(No.2005CB522603)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81272100; No.81372065)；廣州市科技計劃(No.201300000091; No.2015080225)；2014年廣州市花都區(qū)科技計劃(No.HD14CXY001)；暨南大學(xué)青年基金資助項目(No.21614310)

通訊作者△Tel： 020-38688163； E-mail： liuhongwei0521@hotmail.com

[中圖分類號]R758.1； R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.021

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