陳奇彪,　詹雄宇,　呂秀秀,　陳　波,　秦曉平,　陳建帆,　黃　君,　瞿利軍，　卓育敏△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院， 2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

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小檗堿增強阿霉素誘導(dǎo)的膀胱癌T24細胞凋亡*

陳奇彪1,詹雄宇1,呂秀秀2,陳波1,秦曉平1,陳建帆1,黃君1,瞿利軍1，卓育敏1△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 研究小檗堿對阿霉素誘導(dǎo)的膀胱癌T24細胞凋亡的影響及機制。方法: 將膀胱癌T24細胞分為對照組、阿霉素組、阿霉素+小檗堿組和小檗堿組。采用CCK-8試劑盒測定膀胱癌T24細胞的增殖抑制率。采用Hoechst 33258染色劑檢測細胞凋亡，同時測定caspase-3和caspase-9活性以及Bcl-2、Bax蛋白的表達。 結(jié)果: 小檗堿呈劑量和時間依賴性地促進阿霉素誘導(dǎo)的T24細胞凋亡。與阿霉素組比較，小檗堿+阿霉素組caspase-3、caspase-9活性和Bax蛋白的表達水平明顯增加，而Bcl-2蛋白表達水平降低。結(jié)論: 小檗堿可進一步增強阿霉素對T24細胞增殖的抑制作用，其機制與小檗堿增強阿霉素誘導(dǎo)的T24細胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]小檗堿； 阿霉素；膀胱癌T24細胞； 細胞凋亡

非肌層浸潤性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer, NMIBC)目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(transurethral resection of bladder tumor, TURBT)及術(shù)后輔助膀胱內(nèi)灌注化療，主要目的是減少膀胱癌患者的復(fù)發(fā)和進展[1]。臨床研究顯示膀胱灌注阿霉素(doxorubicin, DOX)可以有效預(yù)防淺表性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)及進展[2]。然而，阿霉素的臨床應(yīng)用價值受限于對正常膀胱黏膜上皮的毒副作用，并且部分病人仍然復(fù)發(fā)[3]。因此，尋找一種對膀胱癌有更高療效，又能保護正常膀胱黏膜上皮的治療方法，具有十分重要的臨床意義。

小檗堿(berberine, Ber)，是一種異喹啉生物堿，已被報道具有多種藥理活性，包括抗腫瘤和心血管保護作用[4-5]。大量證據(jù)表明，小檗堿對多種類型的腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性作用，例如結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等[6-7]。同時，體外實驗證實小檗堿能通過誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞周期及細胞遷移等途徑殺滅膀胱癌細胞[8-9]。此外，Marin-Neto等[10]研究證實小檗堿具有保護和改善心臟功能的作用。還有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可減輕阿霉素引起的心臟毒性[11-12]。有趣的是，Tong等[13]發(fā)現(xiàn)小檗堿可促進阿霉素對人類多種癌細胞和敏感性和抗腫瘤作用。然而，小檗堿是否提高阿霉素抗膀胱癌的作用，目前尚未見報道。因此，本文觀察了小檗堿合并阿霉素對膀胱癌T24細胞生長的影響，并從分子生物學(xué)水平探討其作用機制。

材料和方法

1主要試劑

中性硫酸小檗堿購自Sigma；注射用阿霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；RPMI-1640、0.25%胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自Hyclone；CCK-8試劑盒購自Dojindo；Hoechst 33258 和2’,7’-二氯熒光素雙乙酸鹽、DCFHA-DA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；本研究所用抗體均購自CST；增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自Millipore。

2細胞及培養(yǎng)

人類膀胱癌T24細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。T24細胞使用含5%(或10%)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3實驗方法

3.1CCK-8法檢測T24細胞增殖抑制情況將處于對數(shù)生長期的T24細胞進行消化，制成細胞懸液，以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，分別加入不同劑量的小檗堿(0.5、1、2 μmol/L)和/或阿霉素(1 μmol/L)，每組設(shè)3個復(fù)孔(設(shè)置空白對照組)，置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h及48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度(A)值，計算各組增殖抑制率，上述實驗重復(fù)3次以上。細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

3.2Hoechst 33258 染色法觀察T24細胞凋亡取對數(shù)生長期的T24細胞，按每孔1×106個細胞密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入小檗堿(1 μmol/L)和/或阿霉素(1 μmol/L)，作用24 h后終止培養(yǎng)，設(shè)置空白對照組，棄培養(yǎng)液后每孔加入0.5 mL固定液進行固定10min，用PBS洗滌3次，避光條件下每孔添加0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色10 min后置于熒光顯微鏡下觀察細胞。

3.3Western blotting 檢測T24細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達取對數(shù)生長期的T24細胞，以按每孔1×106個細胞密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，更換小檗堿(1 μmol/L)和/或阿霉素(1 μmol/L)的培養(yǎng)液，同時設(shè)置空白對照組，作用24 h后終止培養(yǎng)，按照細胞蛋白分離和提取試劑盒說明書的步驟提取蛋白。BCA法檢測各組蛋白濃度，計算使用Western blotting 所需樣品濃度，分別將30 μg樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，加入caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2和Bax單克隆抗體及GAPDH內(nèi)參照抗體在4 ℃環(huán)境下孵育過夜，次日TBST漂洗PVDF膜3次后，加入相應(yīng)的Ⅱ抗，并室溫孵育1 h，TBST漂洗PVDF膜3次，之后經(jīng)ECL發(fā)光液孵育，暗室內(nèi)X光膠片成像，用Scion Image 分析軟件進行目的蛋白條帶的灰度值分析，以待測條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示各組相應(yīng)蛋白的表達。

4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件統(tǒng)計分析，所有實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗；2組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1小檗堿增強阿霉素對膀胱癌T24細胞的增殖抑制作用

不同濃度的中性硫酸小檗堿(0.5、1、2 μmol/L)與阿霉素(1 μmol/L)作用于T24細胞24 h和48 h后，細胞密度較為稀疏，細胞之間間隙變大，更多的細胞變圓，部分細胞不貼壁或者貼壁不牢，易被消化離壁，細胞增殖受到抑制。小檗堿聯(lián)合阿霉素藥物組對T24細胞增殖的抑制效果較單用阿霉素藥物組明顯(P<0.05),且其作用具有明顯的時間依賴性(P<0.01)。而不同濃度的小檗堿聯(lián)用阿霉素，對T24細胞增殖的抑制作用無明顯差異,見圖1。

2小檗堿增強阿霉素誘導(dǎo)的膀胱癌T24細胞凋亡

正常細胞的細胞核呈淡藍色，較大較圓，色澤均一，形態(tài)規(guī)則，表面光滑，少有凋亡現(xiàn)象。單用阿霉素組內(nèi)凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染，色偏白，可以看到核碎裂、核固縮、凋亡小體形成現(xiàn)象。小檗堿(1.0 μmol/L)聯(lián)合阿霉素作用T24細胞24 h后，相對于單用阿霉素組、空白對照組，凋亡細胞明顯增多(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.Cell viability of T24 human bladder cancer cells treated with DOX, with or without Ber for 24 h and 48 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；##P<0.01vsDOX group.

圖1小檗堿增強阿霉素對膀胱癌T24細胞增殖的抑制作用

Figure 2.Ber enhanced DOX-induced apoptosis in T24 human bladder cancer cells. Hoechst 33258 staining indicates apoptotic morphological changes in T24 cells were observed after 24 h incubation with DOX, with or without Ber (×100). Con: control. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs DOX.

圖2小檗堿增強阿霉素誘導(dǎo)的膀胱癌T24細胞凋亡

3小檗堿對阿霉素處理的T24細胞caspase-3和caspase-9活性，以及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

Western blotting實驗結(jié)果表明，小檗堿聯(lián)用阿霉素明顯促進T24細胞內(nèi)cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax表達，同時抑制了T24細胞中Bcl-2蛋白的表達水平，見圖3、4。

Figure 3.The effects of Ber on cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 protein levels in DOX induced-T24 cells. Con: control. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsDOX group.

圖3小檗堿增強阿霉素誘導(dǎo)的膀胱癌T24細胞 cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達

Figure 4.The effects of Ber on the protein expression of Bcl-2 and Bax in T24 cells treated with DOX (1.0 μmol/L) for 24 h. Con: control. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs DOX group.

圖4小檗堿對阿霉素誘導(dǎo)的T24細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

討論

研究證實，小檗堿具有抗腹瀉、抗腫瘤和抗糖尿病多種藥理作用[4-5]，同時對治療慢性充血性心臟衰竭具有顯著的療效[10]。重要的是，近期研究報道小檗堿可通過誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯起抗癌和抗癌轉(zhuǎn)移作用[8-9]。此外，阿霉素仍然是目前臨床常用的抗腫瘤化療藥物，而小檗堿聯(lián)合阿霉素作用于膀胱癌T24細胞株的體外研究，目前尚未見報道。

本文采用CCK-8法發(fā)現(xiàn)小檗堿能增強阿霉素對膀胱癌T24細胞增殖的抑制，同時采用Hoechst 33258染色法從細胞形態(tài)學(xué)上觀察到聯(lián)合藥物組比單獨藥物組的凋亡細胞增多。

細胞凋亡是細胞在基因調(diào)控下的自殺現(xiàn)象，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)意義，目前多種化療藥物主要通過誘導(dǎo)癌細胞的凋亡進而抑制腫瘤生長增殖。細胞凋亡是由caspase家族介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)過程，而caspase-3是不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所介導(dǎo)的細胞凋亡過程的關(guān)鍵執(zhí)行酶，是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的“公共通路”。研究證實小檗堿可通過介導(dǎo)caspase-9-caspase-3的內(nèi)源性凋亡信號通路誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的凋亡[8-9]。Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)小檗堿聯(lián)合阿霉素誘導(dǎo)T24細胞中關(guān)鍵凋亡蛋白caspase-3的活性亦顯著增加，同時caspase-9的活性亦顯著增加，這提示小檗堿能夠促進阿霉素誘導(dǎo)T24細胞的凋亡。

Bcl-2家族成員廣泛存在于線粒體膜上，包括促凋亡蛋白(Bax，Bad)和抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-xL)，兩者之間的比例對細胞的命運起決定作用。Bax作用于線粒體上，誘發(fā)線粒體膜通透性改變，引起細胞色素C的釋放，引發(fā)caspase家族級聯(lián)反應(yīng)，進而啟動細胞凋亡程序[14]。本研究表明，小檗堿聯(lián)合阿霉素作用于T24細胞后，相對于單獨藥物組、空白對照組，細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著下降，而促凋亡蛋白Bax水平顯著升高，這表明小檗堿可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族表達變化介導(dǎo)caspase家族級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)膀胱癌T24細胞凋亡。

綜上所述，本研究在分子生物學(xué)水平驗證了小檗堿聯(lián)合阿霉素具有明顯抑制膀胱癌T24細胞生長的作用，其主要途徑是促進T24細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)Bcl-2/Bax的比例，活化caspase-3有關(guān)。小檗堿聯(lián)合阿霉素作為新的抗膀胱癌治療策略具有潛在臨床價值，這為預(yù)防和治療膀胱癌、保護膀胱黏膜上皮提供新的實驗依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Berberine promotes anti-proliferative effects of doxorubicin in T24 bladder cancer cells by enhancing apoptosis

CHEN Qi-biao1, ZHAN Xiong-yu1, Lü Xiu-xiu2, CHEN Bo1, QIN Xiao-ping1,CHEN Jian-fan1, HUANG Jun1, QU Li-jun1, ZHUO Yu-min1

(1The First Affiliated Hospital,2Department of Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, China. E-mail:tzhuoyumin@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of berberine (Ber) on doxorubicin (DOX)-induced apoptosis in bladder cancer T24 cells. METHODS: The cells were exposed to DOX in the presence or absence of different concentrations of Ber. The viability of the cells was determined by CCK-8 assay. The apoptosis was measured by Hoechst 33258 staining and the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting.RESULTS: Ber enhanced the inhibitory effect of DOX on the viability of T24 cells and promoted DOX-induced apoptosis in T24 cells. DOX increased the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 and Bax, all of which were enhanced by treatment with Ber. In contrast, Ber exposure further decreased the expression of Bcl-2 in DOX-treated T24 cells.CONCLUSION: Ber enhances the anti-proliferative effects of DOX through promoting apoptosis in bladder cancer cells.

[KEY WORDS]Berberine; Doxorubicin; Bladder cancer T24 cells; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0847- 05

[收稿日期]2015- 11- 10[修回日期] 2016- 01- 18

*[基金項目]廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. S2013010016503)；暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育專項基金資助項目(No. 2014105)

[中圖分類號]R730.23

[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.013

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