涂　劍，　陸凱強(qiáng)，　丁維珂，　劉曉旺，　熊　婷，　劉　伶，　嚴(yán)　欣，　周志剛

(南華大學(xué) 1藥物藥理研究所， 2第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001)

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T0901317通過上調(diào)LXRα表達(dá)促進(jìn)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡*

涂劍1，陸凱強(qiáng)1，丁維珂1，劉曉旺1，熊婷1，劉伶1，嚴(yán)欣1，周志剛2△

(南華大學(xué)1藥物藥理研究所，2第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001)

[摘要]目的： 觀察肝X受體(LXR)激動劑T0901317對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡的作用及其機(jī)制。方法: 不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)T0901317處理人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞不同時間(0、12、24、48 h)，用Hoechst 33342染色及流式Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；Western blot進(jìn)一步檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3和LXRα的表達(dá)，RT-qPCR檢測Bcl-2和LXRα的mRNA表達(dá)。結(jié)果: 隨著T0901317處理濃度的增加和時間的延長，凋亡現(xiàn)象逐漸明顯。進(jìn)一步通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，T0901317可下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，cleaved caspase-3表達(dá)增多，而LXRα的表達(dá)上調(diào)；RT-qPCR檢測結(jié)果也顯示，T0901317可下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，而上調(diào)LXRα表達(dá)。結(jié)論: T0901317能上調(diào)LXRα表達(dá)，從而促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]T0901317； 肝X受體α； MDA-MB-231細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

近年有研究指出，肝X受體(liver X receptor, LXR)激動劑T0901317可抑制多種腫瘤包括乳腺癌細(xì)胞的增殖[1-4]。另有文獻(xiàn)提出，T0901317還能誘導(dǎo)前列腺癌和黑色素瘤細(xì)胞凋亡[5-6]。那么，T0901317對乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制如何？雖有文獻(xiàn)提示[7]，迄今未見具體報道。本研究主要圍繞T0901317對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響展開。

材料和方法

1材料

MDA-MB-231細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；T0901317為Cayman產(chǎn)品；Hoechst 33342和β-actin的 I抗購自Sigma；Annexin V-FITC/PI試劑盒來自Becton-Dickinson；LXRα的 I 抗(Epitomics)；Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3的 I抗(CST)； II 抗均購自聯(lián)科生物公司；TRIzol購自Invitrogen；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo；LXRα、Bcl-2和β-actin引物由上海生工合成。

2方法

2.1Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡濃度分別為0、10、20和40 μmol/L的T0901317處理細(xì)胞24 h，4%多聚甲醛固定。Hoechst 33342染色液室溫下避光孵育，封片后用熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.2流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡分別加入濃度為0、10、20和40 μmol/L的T0901317處理MDA-MB-231細(xì)胞不同時間(0、12、24、48 h)，PBS清洗、回收至相應(yīng)流式管內(nèi)。加入不含EDTA的0.25%的外用胰酶消化，吹打后的懸液吸入對應(yīng)的流式管中，稍混勻。1 800 r/min離心3 min，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)2次。1 500 r/min離心5 min，棄上清，每管加入195 μL Annexin V-FITC buffer輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染液輕柔混勻。室溫避光孵育20 min，冰浴后迅速使用流式細(xì)胞儀檢測樣品，Annexin V-FITC激發(fā)綠色熒光而PI則激發(fā)紅色熒光。

2.3Western blot法檢測細(xì)胞中LXRα、Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平收集各組細(xì)胞，蛋白定量后加入適量5×上樣緩沖液，沸水煮10 min，積層膠80 V、分離膠120 V電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉約2 h，分別加入 I 抗4 ℃過夜，TBST洗滌3次；再加入 II 抗，37 ℃孵育0.5 h，TBST洗滌4次；用Western blot熒光檢測試劑盒顯影，以內(nèi)參為對照，掃描結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2.4RT-qPCR檢測LXRα和Bcl-2的mRNA含量按照試劑盒說明書采用TRIzol溶液提取各組細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒程序得到相應(yīng)的cDNA。LXRα的上游引物序列為5’-TCTGGAGACATCTCGGAGGTACAAC-3’，下游引物序列為5’-AGCAAGGCAAACTCGGCATC-3’；Bcl-2上游引物序列為5’-CTGCACCTGACGCCCTTCACC-3’，下游引物序列為5’-CACATGACCCCACCGAACTCAAAGA-3’。加cDNA 0.1 μL，相應(yīng)基因上、下游引物各1 μL，用無酶水補(bǔ)齊至20 μL，使用95 ℃30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。根據(jù)Ct值，使用2-ΔΔCt法統(tǒng)計結(jié)果。

3統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計處理，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1T0901317對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

與control組比較，隨著T0901317處理濃度的增加，細(xì)胞核發(fā)生固縮，核膜溶解，細(xì)胞核明顯縮小甚至碎裂，形態(tài)呈不規(guī)則狀，熒光不均且強(qiáng)度變大，部分細(xì)胞可觀察到凋亡小體，尤以20 μmol/L和40 μmol/L的T0901317處理細(xì)胞組更為明顯，見圖1A。

流式結(jié)果顯示，T0901317處理MDA-MB-231細(xì)胞 12 h后，與control組相比，20 μmol/L以及40 μmol/L組出現(xiàn)了凋亡，而處理24 h以及48 h發(fā)現(xiàn)20 μmol/L以及40 μmol/L組的凋亡更明顯，活細(xì)胞總數(shù)下降,見圖1B。上述結(jié)果提示，T0901317可隨濃度的增加和時間的推移明顯誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

Figure 1.The effect of T0901317 on the apoptosis of MDA-MB-231 cells. A: Hoechst 33342 staining (×200); B: Annexin V/propidium iodide staining and flow cytometry.

圖1T0901317對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

2T0901317對MDA-MB-231細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和LXRα蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，隨著T0901317處理濃度的增加，與0 μmol/L組相比，LXRα蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減弱，cleaved caspase-3蛋白量增加明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。隨著T0901317處理時間的延長，與0 h組相比，LXRα蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，但是cleaved caspase-3的蛋白量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05),見圖2。以上結(jié)果說明隨著T0901317孵育濃度的增加和時間的延長，可明顯促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

Figure 2.The effect of T0901317 on the protein levels of LXRα and apoptosis-related proteins， such as Bcl-2 and cleaved caspase-3， in MDA-MB-231 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P< 0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.

圖2T0901317對MDA-MB-231細(xì)胞中LXRα和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

3T0901317對MDA-MB-231細(xì)胞中LXRα和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與control組相比，隨著T0901317處理濃度的增加，LXRα 的mRNA水平明顯增高，Bcl-2的 mRNA表達(dá)明顯降低。與0 h組相比，隨著T0901317處理時間的延長，LXRα的mRNA水平明顯增高，Bcl-2的mRNA表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。這說明T0901317能上調(diào)LXRα的mRNA水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表達(dá)。

Figure 3.The effect of T0901317 on the mRNA expression of LXRα and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.

圖3T0901317對MDA-MB-231細(xì)胞中LXRα和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

討論

乳腺癌的發(fā)病機(jī)理至今仍未闡明，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡可作為生物治療的一種有效手段[7-9]。而T0901317能否誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，成為乳腺癌防治的新藥？El Roz 等[7]2012年報道，MCF-7細(xì)胞中激動LXR可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，抑制細(xì)胞增殖，略有提示檢測了其間細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的基因表達(dá)。據(jù)此，我們圍繞T0901317對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響做了系統(tǒng)的檢測。

不僅MCF-7細(xì)胞，針對MDA-MB-231細(xì)胞，我們運(yùn)用Hoechst 33342染色和流式Annexin V-FITC/PI雙染法檢測，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)隨著T0901317處理濃度的增加，活細(xì)胞總數(shù)下降，細(xì)胞核發(fā)生固縮甚至碎裂，熒光不均且強(qiáng)度變大，可觀察到凋亡小體。

半胱天冬酶(caspase)在正常細(xì)胞處于非活化的酶原狀態(tài)；被活化后，可經(jīng)凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生不可逆的凋亡[10]。Caspase-3在caspase家族中是數(shù)條細(xì)胞凋亡信號通路的下游聚點(diǎn)，一般為最后決定其細(xì)胞死亡的關(guān)鍵蛋白激酶，可作為凋亡發(fā)生的觀察指標(biāo)之一[11-12]。而Bcl-2蛋白屬于 Bcl-2 蛋白家族抗凋亡蛋白[13]。我們的檢測結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，caspase-3蛋白的表達(dá)量不變或略為增加，cleaved caspase-3蛋白量明顯增加，說明caspase-3被激活。進(jìn)一步提示T0901317隨孵育細(xì)胞濃度的增加和時間的延長，明顯促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

凋亡過程受到多種細(xì)胞內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，其中NF-κB通路在炎癥、細(xì)胞增殖及凋亡等過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[14-15]。有研究表明，NF-κB可以調(diào)控多種與凋亡相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞凋亡[16]。且NF-κB抑制細(xì)胞凋亡主要是上調(diào)擁有相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的抗凋亡基因(如Bcl-2)的表達(dá)[17]。T0901317是肝X受體人工合成激動劑，尤其對LXRα具有高親和力。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，T0901317上調(diào)了LXRα的mRNA和蛋白表達(dá)。我們另有結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T0901317可下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)[18]，而生物信息學(xué)分析提示，人LXRα序列含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[19]。這是否提示T0901317促使乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能通過LXRα/NF-κB p65/Bcl-2途徑。接下來我們將進(jìn)一步通過激動劑和阻斷劑的應(yīng)用探討T0901317誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

綜上所述，我們認(rèn)為T0901317能上調(diào)LXRα的表達(dá)，誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

T0901317 induces apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells by up-regulating LXRα expression

TU Jian1, LU Kai-qiang1, DING Wei-ke1, LIU Xiao-wang1, XIONG Ting1, LIU Ling1, YAN Xin1, ZHOU Zhi-gang2

(1Institute of Pharmacy and Pharmacology，2The First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, China. E-mail: zhouzhigang0734@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the pro-apoptotic effect of T0901317, an artificial agonist of liver X receptor α (LXRα), on human breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. METHODS: MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations (0, 10, 20 and 40 μmol/L) of T0901317 for different time (0, 12, 24 and 48 h). The cell apoptosis was determined by Annexin V/propidium iodide staining and Hoechst 33342 staining. The expression of apoptosis-related proteins, such as Bcl-2, caspase 3 and cleaved caspase-3, and LXRα was determined by Western blot. The mRNA expression of Bcl-2 and LXRα was analyzed by RT-qPCR. RESULTS: T0901317 induced the cell apoptosis in a dose-and time- dependent manner. The expression of cleaved caspase-3 and LXRα was up-regulated, but Bcl-2 was down-regulated by T0901317. The mRNA expression of Bcl-2 was down-regulated, while LXRα was up-regulated by T0901317.CONCLUSION: T0901317 up-regulates LXRα expression and induces the apoptosis of MDA-MB-231 cells.

[KEY WORDS]T0901317; Liver X receptor α; MDA-MB-231 cells; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0836- 05

[收稿日期]2015- 12- 21[修回日期] 2016- 02- 23

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81541163); 湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2015JJ3101); 湖南省教育廳創(chuàng)新平臺項(xiàng)目(No. 15K111);“湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心”培育項(xiàng)目(No. 2014-405)

[中圖分類號]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.011

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