金銀秀，王玉新，石 雷，沈佩佩，夏念友，游錦晨，李姿生

(臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)制藥研究所，浙江 臺(tái)州 318000)

奧卡西平(Oxcarbazepine，OXC)是一種治療癲癇部分發(fā)作和全身強(qiáng)直陣孿性發(fā)作的新藥[1]。與卡馬西平相比，具有不良反應(yīng)少、自身誘導(dǎo)作用小等優(yōu)點(diǎn)，其體內(nèi)過程主要通過胃腸道快速吸收并迅速、幾乎完全降解為有藥理活性的代謝產(chǎn)物10，11-二氫-10-羥基卡馬西平(monohydroxycarbazepine，MHD)而發(fā)揮作用[2]。但由于OXC幾乎不溶于水，其普通制劑在水中不易潤(rùn)濕和擴(kuò)散，用常規(guī)的制劑輔料和分散系統(tǒng)制備的口服劑型在胃腸液中易于結(jié)晶或沉淀析出，極大地影響了藥物的溶出和吸收。近年來，出現(xiàn)了一些新型的藥物傳遞系統(tǒng)，其中納米脂質(zhì)載體受到了越來越多的關(guān)注[3-5]。納米脂質(zhì)載體具有脂質(zhì)藥物載體的固有優(yōu)勢(shì)：難溶性藥物在脂質(zhì)成分中表現(xiàn)出良好的溶解度，引入液體脂質(zhì)可以增加藥物的包封率和載藥量；所使用的脂質(zhì)具有生理相容性，體內(nèi)毒性低；納米粒子的固體骨架結(jié)構(gòu)使其具有良好的穩(wěn)定性；具備與固體脂質(zhì)納米粒相似的緩控釋特性[6-7]。因此進(jìn)行OXC納米脂質(zhì)載體的研究是解決上述問題的有益探索。納米脂質(zhì)載體易于加工成傳統(tǒng)劑型，如片劑、膠囊等[6]。作者研究制備了OXC納米脂質(zhì)載體，可以進(jìn)一步制成凍干粉以供臨床使用。為了更好地控制OXC納米脂質(zhì)載體的質(zhì)量，建立了其包封率的測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

奧卡西平對(duì)照品：批號(hào)100657-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；奧卡西平：批號(hào)140530，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，浙江九洲藥業(yè)股份有限公司；卵磷脂：批號(hào)J1422068，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>70%，阿拉丁試劑(上海)有限公司；大豆油：批號(hào)20140429，上海嘉里食品工業(yè)有限公司；聚山梨酯80(Tween-80)：批號(hào)20131220，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖凝膠( Sephadex G50)：批號(hào)20140703，臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；乙腈、甲醇：色譜純；水為蒸餾水，其它試劑均為分析純，市售。

Agilent 1220型高效液相色譜儀：可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌儀：金壇市精達(dá)儀器制造廠；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；GL-20M型高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 OXC納米脂質(zhì)載體制備[8]

1.2.1 OXC納米脂質(zhì)載體制備

取10 mg OXC，0.1 g卵磷脂，0.15 g大豆油，0.4 g Tween-80精密稱定，溶解于10 mL乙酸乙酯中，超聲至完全溶解，構(gòu)成有機(jī)相。將有機(jī)相倒入30 mL水中，充分?jǐn)嚢瑁? min，得乳濁液；將得到的乳濁液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑乙酸乙酯，得到澄清均一的溶液即為奧卡西平納米脂質(zhì)載體。

1.2.2 空白納米脂質(zhì)載體的制備

取除主藥OXC外的其它成分按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得空白納米脂質(zhì)載體。

1.3 OXC含量測(cè)定方法的建立

1.3.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH= 4.5)-乙腈-甲醇(體積比為15∶45∶40)；流速1.2 mL/min；柱溫50 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 溶液制備

取OXC納米脂質(zhì)載體及空白納米脂質(zhì)載體各1 mL，加流動(dòng)相定容至10 mL，超聲5 min，破壞其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，作為供試品溶液和空白樣品溶液。取OXC 0.010 0 g精密稱定，流動(dòng)相溶解定容至25 mL，精密吸取1.0 mL至10 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容，得到質(zhì)量濃度為40.00 μg/mL的OXC對(duì)照品溶液。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 專屬性

取空白樣品溶液、OXC對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。

1.3.3.2 線性關(guān)系考察

取OXC 0.010 4 g精密稱定，用流動(dòng)相定容至250 mL作為母液，分別稀釋為質(zhì)量濃度0.16、0.31、0.62、1.04、2.16、5.16、20.8、31.2、41.6 μg/mL溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

1.3.3.3 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取1.04 μg/mL對(duì)照品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定 6 次。

1.3.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品，平行6份，按“1.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密移取9份空白納米脂質(zhì)載體溶液1 mL，分別加入OXC對(duì)照品溶液，流動(dòng)相定容至10 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為0.324、3.24、32.4 μg/mL的溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。

1.4 包封率測(cè)定方法

1.4.1 葡聚糖凝膠柱層析法

1.4.1.1 洗脫曲線的建立

采用葡聚糖凝膠柱層析法分離載藥納米脂質(zhì)載體，HPLC法測(cè)定游離藥物的含量。稱取葡聚糖凝膠(G50)2.5 g，加純化水水浴加熱煮沸溶脹2 h，靜置溶脹12 h。裝柱平衡，精密吸取OXC納米脂質(zhì)載體溶液1 mL上樣，用純化水洗脫，流速1.5 mL/min，每管1 mL，收集洗脫液40管后，改用質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的甲醇洗脫，收集洗脫液40管[9]。洗脫下來的溶液每毫升加無水甲醇2 mL，加流動(dòng)相2 mL，渦旋15 s，用0.22 μm的有機(jī)膜過濾，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.4.1.2 柱回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取OXC納米脂質(zhì)載體溶液1 mL，按上述方法過柱分離，取全部80 mL洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，甲醇清洗旋蒸瓶并定容至10 mL，超聲5 min后，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。另取OXC納米脂質(zhì)載體溶液1 mL，甲醇定容至10 mL，超聲5 min后，同法測(cè)定，計(jì)算柱回收率。

1.4.1.3 包封率的測(cè)定

取OXC納米脂質(zhì)載體溶液1 mL，加無水甲醇2 mL，加流動(dòng)相2 mL，渦旋15 s用0.22 μm的有機(jī)膜過濾，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，得到OXC納米脂質(zhì)載體溶液中藥物總量為ρ總，按上述方法，用純化水洗脫，收集洗脫液前40 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，甲醇清洗旋蒸瓶并定容至10 mL，超聲5 min后，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，得到OXC納米脂質(zhì)載體包封藥物的ρ包。OXC納米脂質(zhì)載體包封率=ρ包/ρ總。

1.4.2 高速冷凍離心法[9]

1.4.2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

取處方量的OXC精密稱定，純化水定容至25 mL，取2 mL置離心管中高速冷凍離心(離心條件為22 000 r/min，4 ℃)45 min，傾去上層清液，用甲醇溶解底部沉淀物并定容至10 mL，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。將空白納米脂質(zhì)載體溶液按上述方法離心。將處方量的OXC與空白納米脂質(zhì)載體溶液混合，按上述方法離心并測(cè)定。

1.4.2.2 包封率測(cè)定

精密吸取OXC納米脂質(zhì)載體溶液2 mL按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法離心并分析測(cè)定，計(jì)算游離藥物的ρ游。精密吸取OXC納米脂質(zhì)載體溶液2 mL，用甲醇定容至10 mL，超聲10min破乳，破乳后液體取0.5 mL稀釋至10 mL，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算出總藥物的質(zhì)量濃度ρ總。OXC納米脂質(zhì)載體包封率=(1-ρ游/ρ總)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖見圖1。

t/min空白樣品溶液

t/min供試品溶液

t/minOXC對(duì)照品溶液圖1 高效液相色譜法圖

由圖1可見，處方中其它成分不干擾OXC的定量分析。線性關(guān)系考察以O(shè)XC質(zhì)量濃度(ρ) 為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=27.86ρ+5.626，r=0.999 8(n=9)。結(jié)果表明，ρ(OXC)在0.16～41.6 μg/mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度實(shí)驗(yàn)中對(duì)照品峰面積的RSD=0.45%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)得平均ρ(OXC)=24.22 μg/mL，RSD=0.81%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果低、中、高3種濃度的平均回收率為100.8%，RSD=1.24%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 包封率測(cè)定結(jié)果

2.2.1 葡聚糖凝膠柱層析法

洗脫曲線的測(cè)定結(jié)果顯示在前40 mL無游離藥物被洗脫出來，在第55～65 mL洗脫液里檢測(cè)出游離藥物，表明游離藥物與包封藥物能有效分離。OXC平均柱回收率為99.62%(n=3)，結(jié)果表明葡聚糖凝膠柱層析法可用于OXC納米脂質(zhì)載體包封率的測(cè)定。測(cè)得OXC納米脂質(zhì)載體的包封率為(98.16±1.59)%。

2.2.2 高速冷凍離心法[9]

方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示OXC沉淀藥物量為97.81%，空白納米脂質(zhì)載體溶液離心后底部未見沉淀，處方量的OXC與空白納米脂質(zhì)載體溶液混合后離心，測(cè)得沉淀藥物量為95.53%。結(jié)果表明，高速離心法測(cè)定OXC納米脂質(zhì)載體的包封率可行。測(cè)得OXC納米脂質(zhì)載體的包封率為(95.73±0.77)%。

3 結(jié) 論

采用葡聚糖凝膠柱層析法和高速冷凍離心法較好地分離納米脂質(zhì)載體與游離藥物，并采用高效液相色譜法測(cè)定藥物的含量，方法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該法可用于OXC納米脂質(zhì)載體中藥物包封率的測(cè)定。

參 考 文 獻(xiàn)：

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