杜青，王宇紅，△，趙洪慶，楊蕙，孟盼，徐雅嵐

糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬血腦屏障結(jié)構(gòu)的損傷及其機制*

杜青1，王宇紅1，2△，趙洪慶1，楊蕙2，孟盼1，徐雅嵐1

(1．湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙410208; 2．湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙410007)

目的:研究糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬血腦屏障結(jié)構(gòu)關(guān)鍵蛋白緊密連接蛋白(ZO-1)、基底膜蛋白(CoIV)、周細胞蛋白(a-SMA)的表達情況及其損傷機制。方法:采用高脂灌胃14 d后，再尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，38 mg/kg)，隨機分為2組(n=15):糖尿病組和糖尿病并發(fā)抑郁癥組;正常大鼠隨機分為2組(n=15):空白對照組和抑郁癥組。糖尿病組與空白對照組正常飼養(yǎng)，糖尿病并發(fā)抑郁癥組和抑郁癥組慢性不可預(yù)知性應(yīng)激28 d。檢測各組大鼠血糖值的變化，Open-field及Morris實驗評價大鼠行為學(xué)變化，透射電子顯微鏡觀察大鼠海馬血腦屏障形態(tài)學(xué)改變，免疫組化法檢測大鼠海馬血腦屏障關(guān)鍵蛋白ZO-1、CoIV、a-SMA表達情況。結(jié)果:與空白對照組比較，糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠血糖異常升高，自主活動次數(shù)減少，逃避潛伏期延長，空間探索時間減少(P＜0．05，P＜0．01);海馬血腦屏障內(nèi)皮模糊，毛細血管管腔狹窄，周邊膠質(zhì)細胞終足水腫，ZO-1、α-SMA表達顯著減少(P＜0．05)，CoIV的表達顯著增加(P＜0．05);與糖尿病組比較，糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠自主活動次數(shù)顯著減少(P＜0．01)，逃避潛伏期延長(P＜0．05)，海馬血腦屏障毛細血管管腔更為狹窄、膠質(zhì)細胞終足水腫更為明顯，a-SMA表達顯著下降(P＜0．05)。結(jié)論:糖尿病并發(fā)抑郁癥血腦屏障關(guān)鍵蛋白ZO-1、CoIV、α-SMA表達紊亂可能是其結(jié)構(gòu)損傷發(fā)生機制之一。

糖尿病并發(fā)抑郁癥;CoIV;ZO-1;a-SMA;大鼠

糖尿病因長期機體代謝紊亂可誘發(fā)多種組織和器官不同程度的病變，長期的病痛折磨和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)更容易產(chǎn)生嚴(yán)重的心理壓力，在生理與心理的雙重刺激下極易并發(fā)抑郁癥。糖尿病并發(fā)抑郁癥(diabetes mellitus with depression，DD)較糖尿病危害更大，增加了糖尿病患者的自殺率和致殘率，患者自殺的危險性高達10%［1］。國內(nèi)外研究表明［2］，糖尿病和抑郁癥具有生物學(xué)相關(guān)性，兩者皆可損傷血腦屏障結(jié)構(gòu)功能的完整性。血腦屏障由腦毛細血管內(nèi)皮細胞之間緊密連接、毛細血管基膜、星形膠質(zhì)細胞終足和周細胞4層結(jié)構(gòu)構(gòu)成，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能穩(wěn)定特有的重要結(jié)構(gòu)［3］。上述結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白有緊密連接蛋白(zonula occludens-1，ZO-1)、基底膜蛋白(type IV collagen，CoIV)、周細胞蛋白(αsmooth muscle actin，a-SMA)，這些蛋白表達正常與否與血腦屏障的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定密切相關(guān)。因此，本實驗以血腦屏障結(jié)構(gòu)標(biāo)志性蛋白CoIV、ZO-1、a-SMA的表達為切入點，以糖尿病、抑郁癥為模型對照，深入探究糖尿病并發(fā)抑郁癥血腦屏障結(jié)構(gòu)損傷的分子機制。

1 材料與方法

1．1材料

SPF級雄性SD大鼠60只，180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號: SCXK(湘)2013-0004;合格證號:43004700004535。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國Sigma公司);兔抗大鼠CoIV、ZO-1、a-SMA多克隆抗體(武漢博士德有限公司);高脂乳劑(10%膽固醇、0．2%丙硫氧嘧啶、20%豬油、2%膽酸鈉、20%聚山梨酯20%吐溫-80、20%丙二醇，加蒸餾水至100 ml);4%多聚甲醛固定液(0．1 mol/L PBS緩沖液加入40 g多聚甲醛，加熱至55℃～60℃，溶解);2．5%戊二醛固定液，1%鋨酸固定液，10%福爾馬林固定液。

左歸降糖解郁方:黃芪18 g、貫葉連翹3 g、姜黃9 g、熟地黃15 g、山茱萸12 g、枸杞12 g、菟絲子9 g、杜仲9 g、丹參12 g、丹皮6 g、牛膝9 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制成口服液。鹽酸二甲雙胍片:批號1402115，由湖南湘雅制藥有限公司提供;鹽酸氟西汀膠囊:批號2087A，由法國Patheon公司提供。

1．2動物模型的制備

糖尿病動物模型的制備:SD大鼠連續(xù)14 d每天定時灌胃高脂乳劑(10 ml/kg)后，禁食不禁水24 h，尾靜脈一次性注射溶于新鮮配制的枸櫞酸緩沖液(0．1 mol/L、pH 4．5)的STZ(38 mg/kg)，造模3 d后，禁食不禁水12 h，測定空腹血糖，其中≥16．00 mmol/L的大鼠即合格。

抑郁癥動物模型的制備［4］:SD大鼠采用28 d慢性不可預(yù)測性應(yīng)激。刺激因素包括傾籠45°24 h，晝夜顛倒24 h，4℃冰水浴5 min，45℃熱刺激5 min，噪音刺激8 h，潮濕墊料24 h(200 ml/cage)，夾尾1 min。每天進行一種，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。

糖尿病并發(fā)抑郁癥動物模型的制備［5］:采用以上兩種方法聯(lián)合制備DD模型。

1．3分組

60只SD大鼠，按體重隨機選取30只SD大鼠制備成糖尿病模型后，隨機分為糖尿病組、糖尿病并發(fā)抑郁癥組;剩余30只SD大鼠按體重隨機分為抑郁癥組、空白對照組(n=15)。實驗周期為46 d，糖尿病動物模型制備成功后，各組每周進行血糖檢測，直到抑郁癥和糖尿病并發(fā)抑郁癥動物模型造模結(jié)束后，對各組大鼠進行行為學(xué)檢測，然后腹腔取血，其中各組大鼠中的7只灌注后取全腦用于免疫組化檢測，剩余8只取海馬用于電鏡檢測。

1．4空腹血糖測定

動物禁食12 h后，依照血糖儀說明書用血糖試紙檢測血糖。

1．5行為學(xué)檢測

1．5．1 Open-field實驗各組大鼠從80 cm×80 cm ×40 cm、底面均分為25個方格的黑色敞箱的角落放入，適應(yīng)1 min后，拍攝并記錄各組大鼠3 min內(nèi)水平運動格數(shù)(四爪皆進入方可記一次)，垂直豎立的次數(shù)(兩爪騰空放下記一次)，記錄大鼠最后活動總得分，以大鼠自主活動次數(shù)作為評價其抑郁行為的指標(biāo)。

1．5．2 Morris水迷宮實驗將平臺置于D象限，注入清水(水溫23℃～25℃)，水的深度剛好沒過平臺2 cm左右，撒入適量脫脂奶粉并混勻以減少光反射。學(xué)習(xí)能力檢測:第1～4天定位航行實驗，大鼠從不同的方位面向池壁放入，觀察60 s內(nèi)大鼠爬上平臺的逃避潛伏期(escape latency，EL)，若60 s內(nèi)還未爬上，將大鼠引導(dǎo)至臺上，并記入EL為60 s。記憶能力檢測:第5天空間探索實驗，撤走平臺，大鼠自對立象限放入，記錄60 s內(nèi)大鼠在D象限游泳的空間探索時間(space exploration time，SET)。實驗均在上午8∶00-12∶00內(nèi)完成，保持室內(nèi)其他物體位置不變。

1．6樣本采集

24 h禁食不禁水的動物用10%的水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后，固定于手術(shù)臺上，快速剖開胸部使心臟暴露，從左心室心尖處插入灌注刺針同時剪破右新耳，灌注生理鹽水，待流出的液體澄清后，慢速灌注4%多聚甲醛溶液(保存在4℃冰箱內(nèi))至動物四肢僵硬。斷頭取出全腦，固定于4%多聚甲醛溶液中。各組部分大鼠全腦分離雙側(cè)海馬，液氮速凍，-80℃保存。

1．7透射電鏡檢測

取上述各組大鼠海馬組織樣本，用2．5%戊二醛浸泡固定24 h;再用1%鋨酸(OsO4)固定2 h;丙酮逐級脫水，每次10～15 min;環(huán)氧樹脂包埋劑包埋;切超薄片，采用醋酸鈾及拘櫞酸鉛雙重染色，置于銅載網(wǎng)(200目)上，透射電鏡下觀察海馬血腦屏障結(jié)構(gòu)變化，并拍照記錄。

1．8免疫組化檢測

取固定好的全腦組織，用乙醇溶液進行梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟、水化、沖洗，然后滴加封閉液，37℃孵育30 min，去除多余的液體。滴加一抗兔抗大鼠抗體(ZO-1 l∶100)、(CoIV 1∶ 100)、(α-SMA 1∶100)，4℃過夜，37℃溫育45 min，PBS沖洗3次。加入二抗，PBS沖洗3次。滴加SABC，37℃溫育30 min，PBS沖洗3次。滴加DAB顯色7 min，清水沖洗10 min。再用蘇木精輕度復(fù)染2 min，脫水至透明后封片。采用ImagePro軟件分析各組免疫組化的陽性細胞數(shù)。

1．9統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 16．0，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間采用單因素方差分析(One-way-ANOVA)，雙側(cè)t檢驗。

2 結(jié)果

2．1各組大鼠的空腹血糖

與空白組比較，抑郁癥組大鼠空腹血糖比較穩(wěn)定，糖尿病組、糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠血糖隨應(yīng)激時間的延長顯著升高(P＜0．01，表1)。

Tab．1 The levels of blood glucose in rats of each group(mmol/L，n=15，珋x±s)

2．2糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的自主活動

與空白對照組比較，糖尿病組、抑郁癥組、糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠自主活動數(shù)明顯減少(P＜0．01);與糖尿病組比較，糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠自主活動數(shù)明顯減少(P＜0．01)。提示，糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠較糖尿病組大鼠對新鮮事物的探索能力明顯減弱，興趣缺失(表2)。

Tab．2 Independent activities in different groups(n=15，珋x± s)

2．3糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力

在定位航行實驗中，與空白對照組比較，第3、4天，糖尿病并發(fā)抑郁癥組逃避潛伏期明顯延長(P＜0．01)，提示學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低。在空間探索實驗中，與空白對照組比較，其余三組的探索時間均有不同程度的縮短(P＜0．05，表3)。

2．4海馬血腦屏障的結(jié)構(gòu)損傷

空白對照組大鼠海馬血腦屏障毛細血管內(nèi)皮光滑，基底膜薄厚均勻，血管周圍未見水腫;糖尿病組大鼠海馬血腦屏障毛細血管管腔變窄，血管周圍水腫;抑郁癥組大鼠海馬血腦屏障毛細血管周圍有水腫;糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠海馬毛細血管內(nèi)皮邊界凹凸不平，管腔異常狹窄，基底膜有增厚現(xiàn)象，血管周圍水腫明顯。提示，糖尿病并發(fā)抑郁癥組海馬血腦屏障結(jié)構(gòu)損傷最為嚴(yán)重(圖1)。

Tab．3 Results of Morris water maze test in rats of each group(n=15，珋x±s)

Fig．1 Thebloodbrainbarriermorphologicalchangesindifferent groups(×25 000) A:Control group;B:Diabetic mellitus group;C:Depression group;D:Diabetes mellitus with depression group

2．5ZO-1、α-SMA和CoIV蛋白表達變化

與空白對照組比較，糖尿病組、糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠海馬血腦屏障ZO-1、α-SMA免疫陽性細胞數(shù)顯著減少(P＜0．05)，而CoIV免疫陽性細胞數(shù)顯著增加(P＜0．05);提示ZO-1、α-SMA蛋白減少，而CoIV蛋白增加。與糖尿病組比較，糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠海馬血腦屏障α-SMA免疫陽性細胞數(shù)減少(P＜0．05)，提示α-SMA蛋白減少(表4，圖2)。

Tab．4 ZO-1，α-SMA and CoIV immunoreactive cells of hippocampus blood brain barrier in different groups(n= 7，珋x±s)

Fig．2 ZO-1，a-SMA and CoIV immunoreactive cells of hippocampus blood brain barrier in different groups(×400) A:Control group;B:Diabetic mellitus group;C:Depression group;D:Diabetes mellitus with depression group

3 討論

糖尿病以其慢性病的特點成為影響人類健康問題的又一大殺手，而糖尿病患者易于并發(fā)抑郁癥，二者相互影響并可加重病情的發(fā)展。因此，對于糖尿病并發(fā)抑郁癥發(fā)生機制的研究刻不容緩。研究表明，糖尿病與抑郁癥皆可使海馬血腦屏障通透性改變。急性高血糖時，部分內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹，隨著高血糖時間的延長，血腦屏障的整個毛細血管出現(xiàn)變形，血管密度減少并出現(xiàn)動靜脈分流，微血管壁鈣沉積，部分基膜明顯增厚，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)偽足［6］。Najjar S等［7］也通過臨床和實驗研究證實重度抑郁癥存在血腦屏障通透性改變。血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的重要結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)的完整性可憑其屏障功能保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的穩(wěn)定。本課題組前期研究證實，海馬是糖尿病并發(fā)抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵靶器官［5］，而海馬血腦屏障的屏障功能可阻止血液中的有害物質(zhì)的進入保護其免受損害。有文獻表明，糖尿病病理條件下血腦屏障的損傷是通過緊密連接蛋白ZO-1的減少所致的微血管管腔狹窄［8］，α-SMA表達的減少所致的周細胞丟失［9］，CoIV表達增加所致的基底膜增厚［9］、星形膠質(zhì)細胞終足腫脹等形態(tài)學(xué)改變來完成。

ZO-1是一類存在于上皮和血管內(nèi)皮細胞的高分子量磷蛋白，緊密連接胞質(zhì)表面，組織緊密連接的組件與皮層肌動蛋白細胞的骨架進行連接是其功能之一［10，11］。CoIV是廣泛分布于血腦屏障基底膜透明層的核心膠原成分，可與層粘連蛋白結(jié)合形成基底膜的骨架，是基底膜主要的組成蛋白［12］，對血腦屏障的屏障作用維持起著重要作用［13］。有研究表明，糖尿病時由于持續(xù)高血糖從而刺激CoIV及層粘連蛋白的合成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄這些分子的mRNA水平升高，促使毛細血管基底膜增厚［14］。a-SMA表達異常是周細胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志［15］。周細胞表型轉(zhuǎn)化是指周細胞經(jīng)過各種有害機制作用受到損傷，導(dǎo)致細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;在糖尿病病理條件下，氧化應(yīng)激使線粒體發(fā)生損傷，致使血腦屏障周細胞損傷丟失［9］。

本實驗采用反應(yīng)動物自主活動的Open-field實驗以及Morris水迷宮實驗對各組大鼠進行檢測，發(fā)現(xiàn)與糖尿病組相比，糖尿病并發(fā)抑郁癥組大鼠自主活動數(shù)明顯減少，逃避潛伏期延長，空間探索時間減少。提示糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的活動度和對新鮮環(huán)境的好奇程度嚴(yán)重下降，學(xué)習(xí)記憶能力減弱，抑郁癥狀明顯。電鏡結(jié)果進一步表明，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬血腦屏障形態(tài)學(xué)變化較糖尿病、抑郁癥大鼠更為明顯，海馬血腦屏障毛細血管管腔更為狹窄、膠質(zhì)細胞終足水腫更顯著。免疫組化結(jié)果表明糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬血腦屏障結(jié)構(gòu)關(guān)鍵蛋白ZO-1、α-SMA、CoIV的免疫陽性細胞數(shù)紊亂，我們推測:ZO-1、α-SMA蛋白的減少可能使緊密連接的組件無法嵌入細胞骨架、周細胞丟失，雖然CoIV表達的增加使基底膜厚度發(fā)生變化，但整體表現(xiàn)為血腦屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透性增加;糖尿病并發(fā)抑郁癥海馬血腦屏障結(jié)構(gòu)的損傷可能是其發(fā)生機制之一。

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Damages and its mechanism of the blood brain barrier in rats with diabetes mellitus with depression

DU Qing1，WANG Yu-hong1，2△，ZHAO Hong-qing1，YANG Hui2，MENG Pan1，XU Ya-lan1
(1．Training Bases，Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry，Changsha 410208;2．The First Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007，China)

Objective:To investigate the expressions of key proteins type IV collagen(CoIV)，zonula occludens-1(ZO-1)，αsmooth muscle actin(a-SMA)and the mechanisms of the structural injuries of the blood brain barrier in the hippocampus of diabetic rats with depression．Methods:After 14 days of high-fat diet，the rats were treated with streptozotocin(STZ，38 mg/kg，iv)．Then，the animals were randomly divided into 2 groups(n=15):the diabetic group and the diabetes mellitus with depression group．The normal rats were randomly divided into 2 groups(n=15):the control group and the depression group．Diabetic group and controlgroup were kept in normal conditions．The diabetes mellitus with depression group and the depression group were treated with chronic unpredictable stress for 28 days．The levels of blood glucose were detected．The behavior changes of rats were evaluated by open-field test and Morris test．The blood brain barrier morphological changes were observed under the electron microscope．The expressions of CoIV，ZO-1 and a-SMA in rat hippocampal blood-brain barrier were detected by immunocytochemistry．Results:Compared with control group，the level of blood glucose was increased，the number of autonomic activity was decreased，the escape latencies were significantly longer in the Morris water maze test，as well as the space exploration times were shortened in the diabetes mellitus with depression group (P＜0．05，P＜0．01)．The endothelial cells of the hippocampus were blurred，the capillary lumen was narrow，and the peripheral glial cells were edema，the expressions of ZO-1 and a-SMA were decreased(P＜0．05)，while the expression of CoIV was increased(P＜0．05)．Compared with diabetic group，the number of autonomic activity in the diabetes mellitus with depression group was significantly decreased(P＜0．01)，the escape latencies were longer(P＜0．05)，the blood brain barrier capillary lumen was more narrow and the glial cell terminal edema was more obvious，the expression of a-SMA was decreased(P＜0．05)．Conclusion:The abnormal expressions of ZO-1，CoIV and–SMA，key proteins in the hippocampal blood brain barrier，may be involved in the mechanisms of structural damages of the blood brain barrier in diabetes mellitus with depression．

diabetes mellitus with depression;CoIV;ZO-1;a-SMA;rats

R338

A

1000-6834(2016)06-558-05

10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．016

國家自然科學(xué)基金(81373578，81403379，81573965)

2015-09-09

2016-06-12

△【通訊作者】Tel:0731-85369061;E-mail:wyh107@126．com