李 浩黃展森胡志明齊 濤

陳地靈3應(yīng) 穎4張 宇1張 濱1陳 俊1**

1. 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院不育與性醫(yī)學(xué)科 （廣州 510630）;

2. 廣東省梅州市人民醫(yī)院泌尿外科; 3. 廣東省微生物研究所; 4. 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院

2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的構(gòu)建*

李 浩1△黃展森1△胡志明2齊 濤1

陳地靈3應(yīng) 穎4張 宇1張 濱1陳 俊1**

1. 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院不育與性醫(yī)學(xué)科 （廣州 510630）;

2. 廣東省梅州市人民醫(yī)院泌尿外科; 3. 廣東省微生物研究所; 4. 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院

目的探究2型糖尿病性勃起功能障礙（T2DED）大鼠模型的構(gòu)建方法。方法SD大鼠30只，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組10只，飼養(yǎng)普通飼料；實(shí)驗(yàn)組20只，飼養(yǎng)高脂飼料。飼養(yǎng)8周后，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，30mg/kg），對(duì)照組注射同等劑量的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。腹腔注射3d后采用剪尾法測(cè)定隨機(jī)血糖，≥16.7mmol/L則認(rèn)為2型糖尿病（T2DM）建模成功。糖尿病（DM）成模后于2、4、6、8周各測(cè)定一次隨機(jī)血糖及體質(zhì)量；于糖尿病成模后4、8周進(jìn)行進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)，及腹腔胰島素耐量試驗(yàn)（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT）；于糖尿病成模后8周行阿撲嗎啡（apomorphine，APO）實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定每只大鼠的陰莖海綿體內(nèi)壓力（intracavernous pressure，ICP）。測(cè)壓完成后，收集大鼠的血清，進(jìn)行甘油三酯（triglyceride，TG），總膽固醇（total cholesterol，TC），高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol ，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）含量的測(cè)量。結(jié)果（1）高脂喂養(yǎng)及小劑量STZ注射后，實(shí)驗(yàn)組20只大鼠有17只血糖＞16.7mmol/L，與對(duì)照組相比，在注射后第2、4、6、8周實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖均明顯升高（P＜0.05）。（2）IPGTT試驗(yàn)提示糖尿病大鼠存在胰島素抵抗；IPITT試驗(yàn)提示糖尿病大鼠對(duì)胰島素的敏感性下降。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05）；（3）APO實(shí)驗(yàn)提示對(duì)照組大鼠勃起率為100%，實(shí)驗(yàn)組中STZ注射后2只大鼠死亡，余15只大鼠有2只可觀察到勃起。行ICP測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組大鼠的ICP最大值明顯低于對(duì)照組大鼠（P＜0.05）。結(jié)論高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射可成功構(gòu)建T2DED的大鼠模型，APO實(shí)驗(yàn)可以有效可靠地篩選ED動(dòng)物模型。

糖尿病, 2型; 勃起功能障礙; 大鼠

糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction，DED）是難治性ED，嚴(yán)重影響患者及其配偶的生活質(zhì)量。研究表明，在男性糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）人群中ED的患病率高達(dá)50%，是非DM人群的3倍左右，且隨著患者年齡的增長(zhǎng)以及DM病程的延長(zhǎng)，ED患病率明顯升高[1]。在DM人群中，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者占據(jù)絕大多數(shù)，隨著患者人群的大幅增長(zhǎng)，由T2DM導(dǎo)致的ED（T2DED）問(wèn)題將愈發(fā)突出，現(xiàn)有的藥物療效不佳，5型磷酸二酯酶抑制劑（phosphodiesterase type-5 inhibitors，PDE5i）有效率僅為50%左右，更為棘手的是迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[2]。因此，亟需進(jìn)一步對(duì)T2DED的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，以尋找有效的早期預(yù)警指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，而建立動(dòng)物模型是進(jìn)行相關(guān)研究的必要條件。

目前大多數(shù)有關(guān) DED的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究均集中在T1DED模型上，但由于T1DM與T2DM的發(fā)病過(guò)程存在明顯的差異，且T1DM僅占少數(shù)，因此探究與T2DM的自然發(fā)病過(guò)程更為吻合的T2DED模型構(gòu)建方法具有更為重要的意義。然而，在已有的T2DED模型報(bào)道中，建模的方法并沒(méi)有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，模型的篩選多采用阿撲嗎啡（APO）實(shí)驗(yàn)，鮮有應(yīng)用更為客觀的指標(biāo)——陰莖海綿體內(nèi)壓（Intracavernuous pressur，ICP）進(jìn)行評(píng)價(jià)，且不同的實(shí)驗(yàn)室所報(bào)道的成模率存在較大的差異。因此，本研究旨在進(jìn)一步探究驗(yàn)證T2DED動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，同時(shí)采用ICP測(cè)定的方法對(duì)動(dòng)物成模率進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估APO實(shí)驗(yàn)的可靠性，以期為后續(xù)的T2DED研究打下基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只成年雄性無(wú)特定病原體級(jí)（SPF）SD大鼠（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量200g左右，交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)其勃起功能正常。

二、主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma公司），檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液（pH=4.0，江萊生物科技有限公司），羅氏血糖儀和羅氏卓越型血糖試紙（德國(guó)羅氏診斷有限公司）。葡萄糖，胰島素（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院）。甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒，總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。阿撲嗎啡（上海源葉生物科技有限公司），肝素溶液（上海研域生物科技有限公司），BL-420S生理記錄儀（成都泰盟科技有限公司）。

三、方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組20只。對(duì)照組給予普通飲食（按照熱卡百分比計(jì)算，碳水化合物占70%，蛋白質(zhì)占20%，脂肪占10%），實(shí)驗(yàn)組給予高脂飲食（按照熱卡百分比計(jì)算，碳水化合物占20%，蛋白質(zhì)占20%，脂肪占60%），所有大鼠均自由飲水、攝食。飼養(yǎng)8周后，禁食8h，以30mg/kg劑量給予實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），對(duì)照組大鼠同時(shí)注射同劑量的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。腹腔注射3d后采用剪尾法測(cè)定隨機(jī)血糖，≥16.7mmol/L則認(rèn)為2型糖尿病建模成功。于糖尿病成模后每2周分別測(cè)定兩組大鼠的體質(zhì)量、血糖；于糖尿病成模后第4、8周從兩組中各隨機(jī)挑選5只大鼠進(jìn)行IPGTT及IPITT；于糖尿病成模后第8周進(jìn)行APO實(shí)驗(yàn)，3d后，禁食12h分別測(cè)定每一只大鼠的ICP，測(cè)壓完成后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心，取上清，進(jìn)行TG、TC、HDL-C、LDL-C含量的測(cè)量。

（二）STZ溶液的配制

將600mg的STZ溶解于100mL濃度為0.1mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液（pH=0.4）中，濃度為6mg/ mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，注意在冰浴中完成操作，并盡量保持避光。

（三）APO溶液的配制

APO 2 mg 溶解于0.5mg /kg維生素C 及生理鹽水中，調(diào)整濃度為40 μg /mL。

（四）大鼠空腹血糖的測(cè)定

大鼠禁食24h后，采用剪尾法取靜脈血，用羅氏血糖儀及配套的血糖試紙進(jìn)行測(cè)定。

（五）胰島素抵抗的評(píng)估

IPGTT可以評(píng)估胰島素抵抗的情況，具體方法如下：2組大鼠禁食12h后行IPGTT。經(jīng)剪尾法測(cè)定空腹血糖后，接著給予腹腔注射葡萄糖（2g/kg），于注射葡萄糖后30、60、90、120min經(jīng)剪尾法測(cè)定血糖水平。IPITT可以評(píng)估胰島素敏感性的情況，具體方法如下：2組大鼠禁食4h后，經(jīng)剪尾法測(cè)定空腹血糖后，繼而按1unit/kg 給予腹腔注射胰島素，于注射胰島素后30、60、90、120min 經(jīng)剪尾法測(cè)定血糖水平[3,4]。

（六）生化指標(biāo)的測(cè)量

ICP測(cè)量完成后，使用負(fù)壓采血管進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，靜置，離心，取上清，-80℃保存。每組分別取5只大鼠的血清，進(jìn)行TG、TC、HDL-C、LDL-C含量的測(cè)量，具體方法按照南京建成生物工程研究所的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

（七）大鼠勃起功能的評(píng)價(jià)

1. 阿撲嗎啡（APO）實(shí)驗(yàn)：兩組大鼠飼養(yǎng)8周后，將每只大鼠放至透明觀察箱中，室內(nèi)保持安靜，調(diào)整燈光亮度至僅夠觀察，適應(yīng)環(huán)境15min，然后在大鼠頸部松弛皮膚下注射APO 100μg /kg，觀察30min，并記錄每組大鼠陰莖勃起次數(shù)。陰莖膨大、包皮后退、陰莖頭充血、露出即為1 次有效的陰莖勃起。勃起次數(shù)≥1 次，則認(rèn)為是勃起實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，表明該大鼠勃起功能正常；反之，則為ED大鼠[5,6]。

2. 陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）及頸動(dòng)脈壓的測(cè)定：配制5%的戊巴比妥鈉溶液，按30mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。沿腹白線作腹部正中切口打開(kāi)腹腔，于前列腺背外側(cè)找到盆神經(jīng)節(jié)，仔細(xì)辨認(rèn)并游離出長(zhǎng)約5mm的海綿體神經(jīng)。剪開(kāi)陰莖根部皮膚，暴露兩側(cè)陰莖腳，將注有250IU/mL肝素溶液的23G頭皮針插入左側(cè)陰莖海綿體，遠(yuǎn)端連接生理記錄儀（成都泰盟）。利用不銹鋼雙鉤電極鉤住海綿體神經(jīng)進(jìn)行刺激，刺激參數(shù)為：電壓5V，波寬0.2ms，頻率20Hz，每次持續(xù)時(shí)間為60s。同時(shí)分離左側(cè)頸動(dòng)脈，用預(yù)先充滿250 IU/mL肝素溶液的PE50管插入頸動(dòng)脈，遠(yuǎn)端接入生理記錄儀（成都泰盟），測(cè)定大鼠的頸動(dòng)脈壓后，計(jì)算其平均頸動(dòng)脈壓（mean carotid arterial pressure, MAP）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組大鼠的血清脂類(lèi)含量水平，用t檢驗(yàn)；組間比較用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況

經(jīng)過(guò)8周的高脂喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量增加較明顯，體型較為肥胖，活動(dòng)量有所減少。STZ注射3d后有3只大鼠血糖不達(dá)標(biāo)（＜16.7mmol/L），予以剔除。隨著糖尿病病程進(jìn)展，實(shí)驗(yàn)組大鼠開(kāi)始出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦，毛發(fā)干枯、脫毛，反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少等癥狀，部分出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象。STZ注射2周后2只實(shí)驗(yàn)組大鼠因糖尿病并發(fā)癥死亡。對(duì)照組大鼠毛發(fā)光亮柔順、反應(yīng)靈敏、好動(dòng)，體質(zhì)量增加。

二、隨機(jī)血糖及體質(zhì)量變化的比較

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組STZ注射后第6周、第8周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著造模時(shí)間推移，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，對(duì)照組檸檬酸緩沖液注射后第4、6、8周與第3天的體質(zhì)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠于STZ注射后，各時(shí)間點(diǎn)之間的體質(zhì)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，STZ注射后第3天、第2周、第4周、第6周、第8周血糖均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組內(nèi)與實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)不同時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

三、胰島素抵抗評(píng)估結(jié)果

IPGTT和IPITT的結(jié)果如圖1所示，其變化符合2型糖尿病的特征。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05）。

表1 STZ注射后各時(shí)間點(diǎn)大鼠體質(zhì)量的變化

表1 STZ注射后各時(shí)間點(diǎn)大鼠體質(zhì)量的變化

與對(duì)照組比較，*為P＜0.05；與對(duì)照組第3天相比，△P＜0.05

第3天 第2周 第4周 第6周 第8周對(duì)照組 544.90±52.79 592.00±55.89 631.00±64.20△659.55±77.33△689.00±78.06△實(shí)驗(yàn)組 578.65±70.65 576.67±55.54 584.00±54.55 570.67±57.91*549.00±58.83*

表2 STZ注射后各時(shí)間點(diǎn)大鼠血糖值的變化

表2 STZ注射后各時(shí)間點(diǎn)大鼠血糖值的變化

與對(duì)照組比較，*為P＜0.05

第3天 第2周 第4周 第6周 第8周對(duì)照組 5.73±0.64 5.93±0.48 5.91±0.55 5.89±0.86 5.95±0.44實(shí)驗(yàn)組 20.45±2.21*19.24±1.64*19.14±2.37*19.29±3.59*20.49±2.63*

圖1 胰島素抵抗評(píng)估

四、勃起功能評(píng)價(jià)

在注射STZ后第8周對(duì)兩組大鼠進(jìn)行APO實(shí)驗(yàn)，其中對(duì)照組大鼠均可觀察到明顯的陰莖勃起，陽(yáng)性率高達(dá)100%（10/10）。實(shí)驗(yàn)組中有2只大鼠可觀察到較為明顯的陰莖勃起，陽(yáng)性率為13.3%。

在進(jìn)行APO實(shí)驗(yàn)后第3天我們測(cè)定了兩組大鼠的ICP，見(jiàn)表3，圖2。實(shí)驗(yàn)組大鼠的ICP最大值明顯低于對(duì)照組大鼠（分別為38.65±18.23和95.38±20.61），ICP/MAP比值同樣呈現(xiàn)顯著的差異（實(shí)驗(yàn)組為0.29±0.8，對(duì)照組為0.76±0.16），表明在糖尿病成模后第8周實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)明顯的勃起功能障礙。

圖2 對(duì)照組（A）及實(shí)驗(yàn)組（B）大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓力（ICP）及頸動(dòng)脈壓

表3 兩組ICP和MAP測(cè)定結(jié)果

討 論

糖尿?。―M）主要以胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足，伴或不伴胰島素抵抗為病理生理基礎(chǔ)和顯著特征，導(dǎo)致機(jī)體的碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝紊亂，臨床上以慢性高血糖為主要標(biāo)志。糖尿病可分為2種類(lèi)型：胰島素依賴型糖尿病（1型糖尿病，T1DM），多見(jiàn)于青少年，胰島素分泌絕對(duì)不足；胰島素非依賴型糖尿?。?型糖尿病，T2DM），多見(jiàn)于中老年人，胰島素分泌相對(duì)不足，同時(shí)伴有胰島素抵抗。近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式發(fā)生了明顯的變化，糖尿病患者數(shù)量急劇增加。全球糖尿病流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示[7]：2000年全世界DM患者的總?cè)藬?shù)為1.71億 ，2012年達(dá)到3.71億，預(yù)計(jì)到2030年，全球DM患者總?cè)藬?shù)將高達(dá)4.39億。在我國(guó)，糖尿病的患病率也正在逐年快速增長(zhǎng)。據(jù)一項(xiàng)全國(guó)糖尿病流行病學(xué)研究報(bào)道[8]，國(guó)內(nèi)糖尿病的患病率高達(dá)9.7%，換算之后約為9 240萬(wàn)人次。糖尿病及其并發(fā)癥顯然已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)。

勃起功能障礙（ED）作為DM的主要并發(fā)癥之一，在DM人群中的患病率約為35%~90%[9]。DM患者一般比非DM患者早10~15年發(fā)生ED[10]。由于在DM患者中T2DM占據(jù)絕大多數(shù)，約為90%~95%[11]，因此由T2DM所帶來(lái)的ED問(wèn)題將日益突出，然而其發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚，現(xiàn)有的治療手段療效均不能令人滿意，所以有必要進(jìn)一步對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，而建立動(dòng)物模型是進(jìn)行基礎(chǔ)研究的必備條件，故在本研究中主要探索T2DED模型的構(gòu)建。

用于構(gòu)建DED模型的動(dòng)物主要有大鼠、小鼠、狗、猴、貓和兔等。其中大鼠由于具備易于購(gòu)買(mǎi)和飼養(yǎng)、抗感染能力強(qiáng)、繁殖能力強(qiáng)、對(duì)性激素感受能力高等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用最為廣泛。目前有關(guān)DED的研究較多采用的是T1DM大鼠模型，其造模方法已十分成熟，即用大劑量STZ（60~70mg/kg）腹腔注射進(jìn)行誘導(dǎo)，因STZ可特異性損傷胰島β細(xì)胞，使胰島素分泌減少，從而引發(fā)糖尿病癥狀，這與T1DM所具備的胰島素絕對(duì)缺乏的特性相吻合。隨著T2DM患者人群急劇增長(zhǎng)，人們開(kāi)始將目光轉(zhuǎn)向T2DM及其并發(fā)癥的研究，這便對(duì)T2DM動(dòng)物模型的構(gòu)建提出了要求。迄今報(bào)道的T2DM模型主要分為兩類(lèi)：一類(lèi)是以遺傳因素占主導(dǎo)地位的模型，如肥胖Zucker大鼠、瘦素缺乏的肥胖ob/ob小鼠、KK小鼠[12]、自發(fā)性糖尿病GK-Wistar大鼠等，它們一般表現(xiàn)為類(lèi)似于成人2型糖尿病的輕度高血糖、肥胖、高血脂等癥狀；另一類(lèi)是利用小劑量STZ聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的模型[13]。其中高脂飼料喂養(yǎng)可引起大鼠體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗，而小劑量STZ則可進(jìn)一步使胰島細(xì)胞輕度損傷，能夠更好地模擬人類(lèi)2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程，相對(duì)于第一類(lèi)中以遺傳因素占主導(dǎo)的模型更為經(jīng)濟(jì)，且易于復(fù)制以及飼養(yǎng)。因此在本研究中，我們擬采用該法建立T2DM模型。此外，對(duì)于STZ的使用劑量，目前尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。魏占英等[14]采取不同的高脂喂養(yǎng)時(shí)間及不同STZ注射劑量（分別為高脂喂養(yǎng)4周+STZ35mg/kg；高脂喂養(yǎng)4周+STZ38mg/kg；高脂喂養(yǎng)8周+STZ25mg/ kg；高脂喂養(yǎng)8周+STZ30mg/kg；高脂喂養(yǎng)10周+STZ25mg/kg）進(jìn)行T2DM模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間和STZ注射劑量的增加，T2DM大鼠的成模率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，而8周的高脂喂養(yǎng)時(shí)間聯(lián)合30mg/kg的STZ注射可同時(shí)具備高成模率及低死亡率以及血糖穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；程祎等[15]采用不同劑量的STZ（40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg）進(jìn)行造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40mg/kg組與60mg/kg組的成模率存在顯著差異，而60mg/kg組與80mg/kg組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為注射60mg/kg的STZ為構(gòu)建T1DM模型的最適劑量。結(jié)合上述已報(bào)道的1型和T2DM造模方法以及兩種類(lèi)型糖尿病的病理生理過(guò)程，我們認(rèn)為60mg/kg的劑量可造成胰島β細(xì)胞功能明顯損傷，符合T1DM的病理特點(diǎn)，而T2DM的胰島僅有輕度受損，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們擬采用半量30mg/kg作為STZ的注射劑量，目的是模擬胰島的輕度損傷過(guò)程，同時(shí)聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)以使大鼠體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗。

對(duì)于糖尿病后ED成模的時(shí)間點(diǎn)，目前尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。程祎等[15]認(rèn)為利用APO篩選ED模型的最適時(shí)間應(yīng)為糖尿病成模后2周；Qiu等[16]認(rèn)為在糖尿病成模后第4周可作為DED研究的最適時(shí)間點(diǎn)。然而既往大多數(shù)研究多采用8~10周作為時(shí)限，程晨等[17]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病發(fā)病后第8周大鼠的ED發(fā)生率達(dá)65.4%，滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需求。劉貴華等[18]在糖尿病后第10周進(jìn)行APO實(shí)驗(yàn)，其報(bào)道的ED成模率為68%。蘇宏偉等[19]分別研究了糖尿病成模后第8周、12周、16周的ED發(fā)生率，盡管第16周時(shí)大鼠成模率更高，但結(jié)合各時(shí)間點(diǎn)的成模率、死亡率以及實(shí)驗(yàn)周期等問(wèn)題，他們認(rèn)為第8周可作為最適的研究時(shí)間點(diǎn)。在本研究中，我們以第8周作為研究時(shí)間點(diǎn)，對(duì)糖尿病大鼠的ED成模率以及ED篩選方法作進(jìn)一步的驗(yàn)證及研究。

目前用于評(píng)估模型動(dòng)物勃起功能的方法主要有APO實(shí)驗(yàn)以及ICP測(cè)定。APO是一種合成嗎啡衍生物，作為一種短效多巴胺受體激動(dòng)劑，其可誘發(fā)中樞性勃起反應(yīng)，同時(shí)不伴麻醉或鎮(zhèn)痛作用[20,21]。已有許多研究[5,22,23]利用APO實(shí)驗(yàn)進(jìn)行ED動(dòng)物模型的篩選，采用的是頸部松弛皮膚下注射的方法，創(chuàng)傷小且為一過(guò)性效應(yīng)，故經(jīng)篩選合格的動(dòng)物可直接進(jìn)入下一階段的研究。但該方法需要一定的觀察時(shí)間，且受實(shí)驗(yàn)者主觀感受的影響，只能作為ED評(píng)估的定性指標(biāo)。ICP測(cè)定則可以直觀地反映動(dòng)物陰莖海綿體壓力的變化，作為定量指標(biāo)為ED的評(píng)估提供較為準(zhǔn)確客觀的衡量標(biāo)準(zhǔn)[24]，但進(jìn)行該操作時(shí)需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，操作結(jié)束后動(dòng)物通常會(huì)犧牲，不利于進(jìn)一步的研究。為了驗(yàn)證APO實(shí)驗(yàn)在ED篩選中的可靠性，我們同時(shí)進(jìn)行了APO實(shí)驗(yàn)以及ICP測(cè)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠APO實(shí)驗(yàn)100%陽(yáng)性，而實(shí)驗(yàn)組中陽(yáng)性率為13.3%（2/15），實(shí)驗(yàn)組中2只APO（+）大鼠所對(duì)應(yīng)的ICP值分別為80.8mmHg和86.9mmHg，對(duì)應(yīng)的ICP/MAP比值為0.48和0.5，達(dá)到正常大鼠水平，表明兩者的結(jié)果基本相吻合。然而，在實(shí)驗(yàn)組大鼠中，我們還發(fā)現(xiàn)其中2只大鼠的ICP值接近60mmHg，ICP/MAP比值接近0.45，高于實(shí)驗(yàn)組中ED大鼠的平均水平，但APO實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻為（-），分析其可能的原因包括：（1）此時(shí)大鼠勃起功能已然受損，但未達(dá)完全性ED的水平，而ICP作為一個(gè)定量指標(biāo)，可以展現(xiàn)出這樣一種中間狀態(tài)。相反地，APO實(shí)驗(yàn)是一個(gè)定性指標(biāo)，結(jié)果只能為陽(yáng)性或者陰性，從而導(dǎo)致了存在假陰性的可能；（2）也不排除由于觀察時(shí)間較短、實(shí)驗(yàn)人員主觀因素等造成誤差的可能性，這有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，采用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射的方法可成功構(gòu)建2型糖尿病性勃起功能障礙的大鼠模型，成模率較高，且具備經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，而利用APO實(shí)驗(yàn)則可以有效地對(duì)ED動(dòng)物模型進(jìn)行篩選，從而為進(jìn)一步的ED研究提供理想的模型。

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（2016-03-08收稿）

Establishment of type 2 diabetes mellitus rats model with erectile dysfunction*

Li Hao1△, Huang Zhansen1△, Hu Zhiming2, Qi Tao1,
Chen Diling3, Ying Ying4, Zhang Yu1, Zhang Bin1, Chen Jun1**
1. Department of Infertility and Sexual Medicine, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510630, China; 2. Department of Urology, Guangdong Meizhou People's Hospital; 3. Guangdong Institute of Microbiology; 4. Medical College, Shenzhen University

Chen Jun, E-mail: jchen121121@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the establishment method for type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats model with erectile dysfunction.MethodsThirty sprague -dawley rats were randomly divided into two groups. The rats in the control group (n=10) were fed with normal diet and the rats in experimental group (n=20) were fed with high fat diet. Eight weekslater, the rats in the experimental group were injected intraperitoneally with low-dose Streptozotocin (STZ, 30mg/kg), while the rats in the control group were given the same dose of vehicle citrate buffer. After seventy two hours, tail-vein blood were collected for monitoring blood glucose levels, and only rats with a random blood glucose level over 16.7 mmol/L were considered as T2DM rats model. Random blood glucose and body weight of the rats were examined every two weeks. On week 4, 8 after diabetes, intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) were analyzed. On week 8 after diabetes, apomorphine (APO) test was conducted and the intracavernosal pressure (ICP) of each rat was measured. When the measurement of ICP fnished, the serums of rats were collected. Serum triglycerides (TG), total cholesterol(TC), high density lipoprotein cholesterol（HDL - C), low density lipoprotein cholesterin（LDL - C) were measured.Results(1) Under high fat diet and low-dose STZ injection, seventeen rats with T2DM modeling in the experimental group were successfully established. Compare with that of the control group, the blood glucose level in the experimental group were elevated signifcantly on week 2, 4, 6, 8 after STZ injection (P<0.05). (2)IPGTT suggested that insulin resistance existed in diabetic rats and IPITT showed that insulin sensitivity of diabetic rats decreased. Compared with those of the control group, the contents of TG, TC, HDL-C, LDL-C were signifcantly increased in the experimental group (P<0.05). (3)APO test showed that rats in the control group had no ED, while 2 of 15 (2 rats were dead due to hyperglycemia) rats in the experimental group had penile erection. The max ICP of the experimental group rats were lower than that of the control group rats signifcantly (P<0.05).ConclusionType 2 diabetes mellitus rats model with erectile dysfunction were successfully established by high fat diet combined with low-dose STZ injection, and APO test was an effective and reliable method for ED model evaluation.

diabetes mellitus, type 2; erectile dysfunction; rats

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.006

R 698.1; R 587.1

資助：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81370705，81471450）和廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013B021800204）的資助

**通訊作者，E-mail: jchen121121@hotmail.com

△為共同第一作者