黃鏡梅 劉乃勇 許小露 李麗芳 楊 斌 朱家穎（西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

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管氏腫腿蜂感染W(wǎng)olbachia的分子檢測(cè)

黃鏡梅 劉乃勇 許小露 李麗芳 楊 斌 朱家穎
（西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

摘要：Wolbachia是一類(lèi)在節(jié)肢動(dòng)物中廣泛感染的胞內(nèi)共生菌，為了解Wolbachia在管氏腫腿蜂體內(nèi)的感染情況，采用Wolbachia的通用引物、A大組特異性引物和B大組特異性引物對(duì)管氏腫腿蜂體內(nèi)Wolbachia的wsp基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，所獲得的基因片段分別命名為wSgu、wSguA和wSguB，長(zhǎng)度分別為620、572 bp和463 bp?；蛐蛄蟹治霰砻鱳Sgu與wSguB序列間堿基差異較大，同源性僅為60%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該寄生蜂感染了A大組的Wolbachia，但對(duì)于該寄生蜂是否也感染了B大組的Wolbachia尚待確定。

關(guān)鍵詞：管氏腫腿蜂；Wolbachia；wsp基因；PCR；序列分析

Wolbachia（沃爾巴克氏體）是一種廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物中的細(xì)胞內(nèi)共生菌，屬于細(xì)菌門(mén)，變形桿菌α亞門(mén)的立克次氏體，為革蘭氏陰性細(xì)菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，昆蟲(chóng)中Wolbachia的感染率已經(jīng)達(dá)到70%以上［1］。Wolbachia是通過(guò)母系細(xì)胞質(zhì)遺傳，在寄主中能產(chǎn)生多種生殖調(diào)控行為來(lái)保證其在寄主中穩(wěn)定遺傳［2］。目前，對(duì)生物體內(nèi)Wolbachia的檢測(cè)，主要利用其l6S rDNA、ftsZ和wsp等進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列分析［3-6］。由于Wolbachia的wsp基因相對(duì)于其他基因進(jìn)化最快，且在GenBank中登錄的基因量也越來(lái)越多，因而該基因被廣泛運(yùn)用于Wolbachia的感染檢測(cè)［5-6］。根據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)生，將Wolbachia劃分為11個(gè)超群（supergroup A-K）；又根據(jù)wsp基因序列，將主要感染昆蟲(chóng)等的Wolbachia A大組和B大組進(jìn)一步分為12個(gè)亞組［7］。

管氏腫腿蜂（Scleroderma guani）屬膜翅目腫腿蜂科（Hymenoptera：Bethylidae），分布廣泛，是許多鉆蛀性害蟲(chóng)幼蟲(chóng)和蛹的體外寄生蜂，被較為廣泛的應(yīng)用于林間防治天牛、小蠹蟲(chóng)等鉆蛀性害蟲(chóng)。關(guān)于該寄生蜂的生物學(xué)特性等方面均已取得顯著的進(jìn)展［8］。然而，關(guān)于管氏腫腿蜂Wolbachia的感染檢測(cè)仍未有報(bào)道。為此，本研究對(duì)管氏腫腿蜂體內(nèi)Wolbachia的wsp基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)其wsp基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)而了解Wolbachia在該寄生蜂內(nèi)的感染情況，旨在為今后進(jìn)一步研究Wolbachia對(duì)該寄生蜂生殖方式的影響和將管氏腫腿蜂更好地應(yīng)用于鉆蛀害蟲(chóng)的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試?yán)ハx(chóng)源

試驗(yàn)中所用管氏腫腿蜂由黃粉甲蛹在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，取成蜂保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2基因組DNA提取

采用改良的蛋白酶K法，具體方法如下：1）取5頭用超純水洗滌過(guò)的管氏腫腿蜂放在裝有200 μL裂解液（100 mmol Tris-HC1，25 mmol EDTA，500 mmol NaCl，1%SDS，pH 8.0）的1.5 mL離心管中研磨，然后用300 μL裂解液沖洗研磨棒；2）加蛋白酶K至終濃度為100 μg/ mL，50℃水浴4 h；3）加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），離心（14 000 r/ min，5 min），用氯仿-異戊醇（24∶1）重復(fù)抽提1次；4）轉(zhuǎn)移上清至潔凈的1.5 mL離心管中，加入1 mL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，離心（14 000 r/ min，10 min），用75%乙醇洗滌沉淀，充分干燥后用0.5×TE溶解沉淀，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3Wilbachia的wsp基因片段PCR擴(kuò)增

wsp基因片段的PCR擴(kuò)增參照Z(yǔ)hou等［7］的方法，采用wsp基因的通用引物為81F/691R、A大組特異性引物為136F/691R和B大組特異性引物為81F/522R，3對(duì)引物所用擴(kuò)增體系和PCR反應(yīng)程序相同，PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：正向引物和反向引物各（10 μmol/ L）為1.25 μL，DNA模板為2.5 μL，10×PCR buffer為5 μL，dNTP（10 mmol/ L）為1.25 μL，Taq polymerase（Promega）為0.5 μL，MgCl2（25 μmol/ L）為3.75 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下檢測(cè)拍照。

1.4克隆和測(cè)序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按照Axygen凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物純化后，連接至pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板后通過(guò)藍(lán)白斑篩選及菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性重組克隆。最后菌液送至南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5序列分析

用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具進(jìn)行Wolbachia的wsp基因序列檢索和同源性比較，ClustalX1.83軟件［9］對(duì)所測(cè)得的結(jié)果以及GenBank中已登陸的其他相關(guān)物種的wsp基因序列進(jìn)行比對(duì)后，用MEGA 4.0中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并用1 000次自導(dǎo)復(fù)制來(lái)評(píng)價(jià)各分支的置信度［10］。

2　結(jié)果與分析

2.1wsp基因的PCR檢測(cè)

以管氏腫腿蜂基因組DNA為模板，利用wsp基因的通用引物、A大組特異性引物和B大組特異性引物均擴(kuò)增出了wsp基因的目的片段（圖1），說(shuō)明其感染了Wolbachia。根據(jù)所用引物不同，將通過(guò)通用引物獲得的基因片段命名為wSgu，A和B大組特異引物獲得的基因片段分別命名為wSguA 和wSugB。

圖1　管氏腫腿蜂體內(nèi)Wilbachia的wsp基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophorogram of PCR amplification of wsp genes of Wolbachia in Scleroderma guani

2.2wsp基因片段的序列測(cè)定及分析

含目的基因的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用81F和691R通用引物時(shí)，擴(kuò)增獲得的wSgu基因片段長(zhǎng)度為620 bp；采用A大組特異性引物136F和691R擴(kuò)增獲得的wSguA基因片段長(zhǎng)度為572 bp；采用B大組特異性引物81F和522R擴(kuò)增獲得的wSguB基因片段長(zhǎng)度為463 bp。對(duì)測(cè)序獲得的序列分析結(jié)果表明，wSguA序列不正確，因而不進(jìn)行后續(xù)分析，而wSgu和wSguB基因片段已經(jīng)提交GenBank（登錄號(hào)分別為KX001811和KX001812）?；蛐蛄斜葘?duì)結(jié)果表明，wSgu與wSguB序列間堿基差異較大，同源性僅為60%（圖2）。

圖2　管氏腫腿蜂體內(nèi)Wilbachia的wsp基因序列比較Fig.2 Comparisons of wsp gene sequences of Wolbachia in Scleroderma guani

在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST發(fā)現(xiàn)（相關(guān)序列見(jiàn)表1），wSgu和wSguB與A大組序列的一致性高達(dá)87%，因此采用B大組特異性引物獲得的片段并非來(lái)自B大組Wolbachia。系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步表明，wSgu和wSguB同時(shí)聚到A大組，說(shuō)明該寄生蜂感染了A大組的Wolbachia（圖3）。但由于wSguA序列不對(duì)，對(duì)于該寄生蜂是否也感染了B大組的Wolbachia有待進(jìn)一步研究。

表1　GenBank中其他相關(guān)物種的wsp基因序列Table 1 Wsp gene sequences of other related species in GenBank

圖3　Wilbachia的wsp基因序列NJ樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining tree of Wolbachia based on the wsp sequences

3　結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道Wolbachia在許多昆蟲(chóng)體內(nèi)均有感染，是節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)最為豐富的共生微生物之一［11-12］。本試驗(yàn)采用了wsp基因的通用引物、A大組特異性引物和B大組特異性引物，對(duì)管氏腫腿蜂體內(nèi)Wolbachia感染情況進(jìn)行檢測(cè)，從PCR擴(kuò)增結(jié)果得知，該寄生蜂已經(jīng)感染了Wolbachia。另外，雖然獲得了相應(yīng)的基因片段，但是序列分析表明，wSgu 與wSguB序列間核苷酸同源性較低（60%），這很可能與在同一寄主里可能存在多種傳播機(jī)制有關(guān)［13-14］，也可能是復(fù)合感染引起的［15］。系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步支持PCR檢測(cè)結(jié)果，且證實(shí)該寄生蜂感染的是A大組的Wolbachia。雖然在研究中曾多次嘗試鑒定wSguA基因，但均未能成功獲得該基因的正確序列，因此，對(duì)于該寄生蜂是否也感染了B大組的Wolbachia，仍然有待進(jìn)一步研究。Wolbachia在昆蟲(chóng)中感染的檢測(cè)結(jié)果與檢測(cè)時(shí)所用的引物有關(guān)，并且Wolbachia在昆蟲(chóng)中存在2種感染［15-16］（三重感染和復(fù)合感染）以及在昆蟲(chóng)體內(nèi)Wolbachia的A大組和B大組的豐富度不同［17］，如果在檢測(cè)時(shí)若用通用引物就只能判斷出該昆蟲(chóng)被Wolbachia的某一個(gè)大組感染。由于本研究?jī)H采用了Wolbachia的wsp基因來(lái)檢測(cè)Wolbachia在管氏腫腿蜂中的感染情況，以及構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)管氏腫腿蜂所感染W(wǎng)olbachia的類(lèi)型進(jìn)行了分析，雖能得出一些判斷，但還需把wsp基因檢測(cè)與其他16S rDNA等相關(guān)基因檢測(cè)相結(jié)合做進(jìn)一步的驗(yàn)證［18-20］。研究發(fā)現(xiàn)，感染了Wolbachia的昆蟲(chóng)和其它節(jié)肢動(dòng)物的生殖方式受Wolbachia的調(diào)控［11，21］，但其調(diào)控作用因寄主種類(lèi)不同而不同［22］。因此，關(guān)于Wolbachia對(duì)管氏腫腿蜂的生殖調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯張坤）

第1作者：黃鏡梅（1992—），女，碩士生。研究方向：昆蟲(chóng)生理生化與分子生物學(xué)。Email：1025682082＠qq.com。

Molecular Detection of Wolbachia Infection in Scleroderma guani

Huang Jingmei，Liu Naiyong，Xu Xiaolu，Li Lifang，Yang Bin，Zhu Jiaying
（Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province，College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China）

Abstract：Wolbachia is a group of intracellular symbionts ubiquitously occurred in arthropods.To investigate the Wolbachia infection in Scleroderma guani，wsp gene of Wolbachia in S.guani were detected with universal primers and gene-specific primers of A and B supergroups.The sequences obtained were named as wSgu，wSguA and wSguB with the lenth of 620，572 bp and 463 bp，respectively.Gene sequence analysis showed that the difference of base pairs were large between wSgu and wSguB，and their nucleotide identity was only 60%.Phylogenetic analysis showed that this parasitic wasp was infected with A-Wolbachia，while whether this parasitic wasp infected with B-Wolbachia remains to be further investigated.

Key words：Scleroderma guani，Wolbachia，wsp gene，PCR，sequence analysis

通信作者：朱家穎（1984—），男，博士，教授。研究方向：昆蟲(chóng)生理生化與分子生物學(xué)。Email：jyzhu001＠gmail.com。

基金項(xiàng)目：云南省林學(xué)一級(jí)學(xué)科博士點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（林學(xué)學(xué)位授權(quán)學(xué)科項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)）資助；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260449）資助；云南省中青年學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目（2013HB077）資助；云南省高校森林有害生物科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助；西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助。

收稿日期：2015-12-19

doi：10.11929/ j.issn.2095-1914.2016.03.029

中圖分類(lèi)號(hào)：S718.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1914（2016）03-0169-05