鹿小燕，顧　煥，徐　浩，趙　鐵，李　耿

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基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對冠心病“痰”“瘀”證候血清代謝組學的研究

鹿小燕1，顧煥1，徐浩2，趙鐵1，李耿1

摘要：目的 研究冠心病痰證、瘀證病人血清代謝組學特征。方法選擇冠心病穩(wěn)定期病人102例，其中痰證52例、瘀證50例，31名健康者，利用核磁共振譜(GCMS)和色譜/質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用、模式識別技術(shù)等現(xiàn)代分析技術(shù)，比較痰證、瘀證冠心病病人和健康人的代謝物組譜差異，對同病異證病人間代謝物組譜差異進行分析。結(jié)果在多種氨基酸、有機酸、長鏈脂肪酸類、溶血磷脂類、磷脂類、鞘磷脂等代謝物方面，冠心病組相對于健康對照組表現(xiàn)出明顯的差異，其中大部分的差異代謝物也是痰濁組和血瘀組的共性代謝物。冠心病組有機酸、麥芽糖、多種氨基酸較健康對照組明顯升高，而多種不飽和脂肪酸及衍生物、維生素E、膽固醇等顯著降低。痰濁組和血瘀組的特性差異代謝物主要有蘋果酸和琥珀酸，果糖和葡萄糖，甘氨酸和丙氨酸以及棕櫚烯酸等。其中7，10-順十六碳二烯酸和DPA在痰濁組中降低，其余則在血瘀組中濃度升高。 結(jié)論冠心病有特異性的代謝組特征，痰濁和血瘀既有特性差異性代謝物，也有共性代謝物，二者異中有同，同中有異。痰濁和血瘀有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，這與中醫(yī)理論的“痰瘀同源”是一致的，作為致病因子，二者在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化，共同致病，亦即“痰瘀同病”，因而在治療時可以考慮痰瘀同治，提高療效。

關(guān)鍵詞：冠心病；代謝組學；痰證；瘀證；病證結(jié)合；胸痹

痰證、瘀證為冠心病的兩大主要證候，二者?；ゼ鎶A、互為轉(zhuǎn)化，為臨床辨治帶來了困難。目前，冠心病血瘀證的研究較為深入，認為與血液循環(huán)障礙、血小板聚集、血栓形成、微循環(huán)異常等密切相關(guān)，但痰證實質(zhì)研究還比較薄弱，且多局限于某個指標或幾個指標。二者的物質(zhì)基礎(chǔ)有何異同？如何相互影響？能否有更敏感的微觀指標？均亟待闡明。代謝組學技術(shù)融動態(tài)、綜合、分析于一體，從整體角度研究人體代謝網(wǎng)絡在疾病狀態(tài)下的變化規(guī)律，為證候?qū)嵸|(zhì)研究帶來了契機[1-2]。本研究即采用病證結(jié)合研究方法，以冠心病“痰”“瘀”證病人為研究對象，利用代謝組學技術(shù)，通過同病異證病人間代謝物組譜差異分析，探討其證候產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)及異同點。

1資料與方法

1.1診斷標準

1.1.1西醫(yī)診斷標準參照1979年國際心臟病學會和協(xié)會及世界衛(wèi)生組織臨床命名標準化聯(lián)合專業(yè)組的制訂的《缺血性心臟病的命名及診斷標準》。

1.1.2中醫(yī)診斷標準參照1990年中西醫(yī)結(jié)合心血管學會修訂的《冠心病中醫(yī)辨證標準》。血瘀證計分標準參照中國中西醫(yī)結(jié)合學會活血化瘀專業(yè)委員會制定的血瘀證診斷標準。

1.2納入標準年齡35歲～80歲；經(jīng)冠脈造影確診為冠心病，符合西醫(yī)診斷標準及中醫(yī)辨證標準的穩(wěn)定期病人；經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，簽署知情同意書。

1.3排除標準急性心肌梗死；血液系統(tǒng)疾病；合并糖尿病和甲狀腺功能亢進等內(nèi)分泌疾病者；肝腎功能不全或肺心??；惡性腫瘤病人；參加其他臨床試驗者。

1.4一般資料選擇門診、住院的冠心病穩(wěn)定期病人102例，其中痰濁證52例(T組)，平均年齡62.12歲，男43例，女9例；血瘀證50例(Y組)，平均年齡62.22歲，男37例，女13例；健康者31名(C組)，平均年齡63.62歲，男22例，女9例。排除既往冠心病病史、肝腎功能、電解質(zhì)明顯異常者。3組之間年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。

1.5觀察指標及方法冠心病痰濁證、血瘀證病人及健康對照者入組時均空腹抽取肘靜脈血約10 mL，分離血清，-80 ℃冰箱冰凍保存待測。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法進行代謝物測定。

1.5.1樣品制備及衍生化從超低溫冰箱中取血清，室溫解凍，精密移取100 μL血清置于1.5 mL離心管中，加入20 μL十七酸和氯苯丙氨酸混合內(nèi)標溶液后加入300 μL甲醇，渦旋混合30 s，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液作為供試品溶液。將300 μL上清液轉(zhuǎn)移到帶有內(nèi)插管的樣品瓶中，在真空離心濃縮干燥儀上濃縮至干，然后進行三甲基硅烷(TMS)衍生化。將50 μL甲氧胺(15 mg/mL溶解在吡啶中) 溶液加入干燥的樣品中，渦旋振蕩30 s，然后置于搖床中恒溫30 ℃，肟化羰基，90 min后取出，加入50 μL BSTFA (containing 1% TMCS)，渦旋振蕩30 s，靜置于70 ℃鼓風干燥箱中硅烷化反應1 h。

1.5.2氣質(zhì)聯(lián)用分析衍生化后的樣品以不分流模式注入到GCtofMS中進行分析，進樣量為1 μL，色譜柱為DB-5 毛細管柱(30 m ×250 μm，0.25 μm film thickness)，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。進樣溫度設定為270 ℃。柱溫梯度為80 ℃ 維持2 min，然后以10 ℃/min程序升溫至180 ℃，5 ℃/min升至240 ℃，25 ℃ /min升至290 ℃，維持9 min，然后回到起始溫度。傳遞線(transfer line)溫度和離子源溫度分別為260 ℃和200 ℃。質(zhì)譜采用電子轟擊源(70 ev)及全掃描模式，掃描范圍為30 m/z～600 m/z。GCtofMS

代謝組分析平臺樣品前處理-衍生化反應流程詳見圖1。

圖1GCtofMS代謝組分析平臺樣品前處理-衍生化反應流程圖

1.5.3數(shù)據(jù)處理將GCtofMS分析所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)由ChromaTOF工作站軟件以NetCDF格式導出。這些CDF文件用Matlab 7.0工具箱中hierarchical multivariate curve resolution (H-MCR)修改的用戶自定義程序進行數(shù)據(jù)前處理提取特征變量，包括基線矯正、去噪、平滑、對齊，時間-窗口分裂，多元曲線分離(基于多元曲線分離算法)等。所得三維數(shù)據(jù)集包括樣品信息、峰保留時間和峰強度。數(shù)據(jù)集中內(nèi)標和由噪音、柱流失及BSTFA衍生化引起的人造峰須先被除去。

所得數(shù)據(jù)集導入SIMCA-p 11.5 軟件進行多元統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)首先經(jīng)過中心化和Parto處理，然后進行主成分分析(PCA)或偏最小二乘判別分析(PLSDA)。PCA是一種非監(jiān)督的模式識別方法，可以用來判斷多維數(shù)據(jù)集的一般聚類情況。PLSDA是一種有監(jiān)督的模式識別方法，一般用來建立組間的預測模型，判別多維變量在組間是否存在明顯的差異。在本研究中應用軟件中默認的7輪交互驗證方法以防止模式的過度擬合。應用獨立樣本t檢驗比較組間均值是否存在顯著差異，健康者與冠心病病人顯著性差異的標準設為P<0.01，而冠心病組對證和不對證治療前后的顯著性差異標準為P<0.05。計算每個差異變量相應的倍數(shù)變化，以顯示它們在模型組以及治療前后的變化程度。

1.5.4代謝物鑒定通過用NIST MS search 2.0軟件比較質(zhì)譜碎片與NIST 08標準質(zhì)譜庫(相似度超過70%)，并最終用標準品驗證的。

2結(jié)果

2.1基于氣質(zhì)聯(lián)用儀的代謝組學分析及特征變量提取經(jīng)GCMS分析后，各組血清樣本的代謝指紋色譜圖被記錄下來。在一個分析流程中多種不同的體內(nèi)內(nèi)源性代謝物可同時被檢測到。從直觀的色譜圖中可以發(fā)現(xiàn)，有一些譜峰在模型組與對照組之間存在著明顯的差異。但是，這些視覺觀測的結(jié)果需要進一步的統(tǒng)計分析驗證。經(jīng)過峰識別和峰匹配，正、負離子模式分別約有200多個特征變量用于進一步的多維和單維模式識別分析，其中有約100個代謝物被鑒別出來。詳見圖2。

注：A 為血瘀證組；B 為痰濁證組；C 為健康組。

2.2模式識別分析及證候的共性和特性代謝物鑒定

2.2.1冠心病組與健康對照組的PCA和PLSDA從冠心病組和健康對照組樣本的PCA結(jié)果可以看出，健康對照組與冠心病組不能分開(見圖3)。于是進一步采用有監(jiān)督的模式識別方法PLSDA，可以看出兩組可以基本分開，表明冠心病病人和正常人之間的代謝物譜存在一定的差異(見圖4)。

圖3　治療前各組樣本GCMS數(shù)據(jù)的主成分分析

圖4 治療前各組樣本GCMS數(shù)據(jù)的偏最小二乘判別分析

2.2.2冠心病組與健康對照組的差異代謝物的識別和鑒定通過單維t檢驗的方法，識別出健康對照組和冠心病痰濁組病人、健康對照和冠心病血瘀組病人以及冠心病痰濁組和血瘀組之間的差異變量。

冠心病組血清中的有機酸(如乳酸、乙醇酸、琥珀酸、蘋果酸)、麥芽糖及多種必需氨基酸(包括丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、戊二酸、天冬氨酸、4-羥脯氨酸、2-羥戊二酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)相對于健康對照組明顯升高；而2-哌啶酸(賴氨酸衍生物)、甘油醇(甘油、2-磷甘油、3-磷甘油屬于有機化合物)，1，5-酐-D-山梨糖醇(糖的衍生物)，維生素E(高效抗氧化劑，可使細胞膜免受自由基的傷害，保護機體)，膽固醇，多種長鏈不飽和脂肪酸及衍生物[包括肉豆蔻酸、棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸、棕櫚酸、亞油酸甲酯、反式油酸甲酯、順式-11-十八烯酸甲酯、硬脂酸甲酯、亞油酸、油酸、硬脂酸、甲基(8E，11E，14E)-8，11，14-二十二碳三烯酸酯、順式-11，14-二十碳二烯酸、順式-11-二十烯酸、二十烷酸、4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯、肌苷、單硬脂酸甘油酯]則顯著降低。

2.2.3痰濁組和血瘀組的共性和特性代謝物的識別和鑒定同時滿足獨立t檢驗的P1(T vs C)和P2(Y vs C)小于0.05的特征變量作為痰濁和血瘀組的共性代謝標記物。許多冠心病和健康對照者之間的差異代謝物也是痰濁和血瘀的共性代謝物，比如膽固醇，維生素 E，小分子有機酸乳酸和琥珀酸，多元醇肌苷、甘油、麥芽糖等，多種氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸等及多種長鏈脂肪酸類如二十烷酸、順式-11-二十碳烯酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸等及其甲基化物。而痰濁組和血瘀組的特性差異代謝物主要包括有機酸(蘋果酸和琥珀酸)，糖類果糖和葡萄糖，必需氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)以及脂肪酸(棕櫚烯酸)等。

而痰濁組和瘀血組的特性代謝物主要有5-羥色胺(色氨酸的衍生物)/可替寧(生物堿、尼古丁在人體內(nèi)進行初級代謝后的主要產(chǎn)物)、溶血卵磷脂、7，10-十六碳二烯酸、長鏈不飽和脂肪酸DPA和PI(38∶3)，蘋果酸和琥珀酸，果糖和葡萄糖，甘氨酸和丙氨酸以及棕櫚烯酸等。其中7，10-十六碳二烯酸和DPA在痰濁組中降低，其余則在血瘀組中濃度升高。

3討論

近年來，隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變、競爭的日益激烈以及空氣環(huán)境的污染，使冠心病的中醫(yī)證候譜發(fā)生了較大變化，肥胖、飲食不節(jié)、嗜煙酒等使冠心病痰濁證所占比例有所增加，痰證、瘀證成為冠心病最重要的兩大證型[3]。

本研究顯示，與健康組比較，冠心病組在葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝方面均有異常，具體表現(xiàn)在葡萄糖代謝產(chǎn)物、氨基酸明顯增加，脂肪代謝產(chǎn)物顯著降低。葡萄糖是缺氧時較好的能量基質(zhì)，可改善心肌的電和機械性能，維持細胞的超微結(jié)構(gòu)，促進心肌修復力，保持細胞內(nèi)三磷酸腺苷濃度，減少心肌磷酸激酶的丟失和延遲線粒體損傷，冠心病病人存在心肌缺血缺氧，因此葡萄糖的消耗較健康者明顯增加；其次冠心病病人體內(nèi)多種氨基酸增加，尤其必需氨基酸增加更明顯，這與國內(nèi)同行的研究結(jié)果是一致的[4-6]。冠心病病人自由基脂質(zhì)過氧化反應活躍，影響內(nèi)分泌而使分解激素增加，能量消耗加速，導致全身能量缺乏，因而使機體內(nèi)個別氨基酸含量上升。此外本研究顯示冠心病病人體內(nèi)脂肪代謝產(chǎn)物顯著降低，說明體內(nèi)脂肪動員程度下降，血漿脂質(zhì)含量增加，脂肪在體內(nèi)堆積，可使血管內(nèi)皮受損，而過多的氨基酸又為脂質(zhì)合成提供了充足原料，進一步加重了脂質(zhì)代謝的異常，導致脂質(zhì)代謝紊亂，最終促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。冠心病病人與細胞膜保護和免疫功能有關(guān)的代謝物如磷脂、肌苷等代謝物的含量亦比健康對照組降低，表明冠心病病人體內(nèi)細胞膜有一定程度的破壞，免疫功能下降。

大部分冠心病和健康對照組之間的差異也是痰濁組和瘀血組的共性代謝物，比如磷脂、膽固醇，維生素E，小分子有機酸、尿酸，多元醇肌苷、甘油、麥芽糖等，多種非必須氨基酸、多種長鏈不飽和脂肪酸及其甲基化物。肌苷是機體內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)、輔酶A、核糖核酸及脫氧核糖核酸的組成部分，參與機體的物質(zhì)代謝和能量代謝。磷脂是維持生命活動的基礎(chǔ)物質(zhì)，是細胞膜的重要組成部分，可以分解過高的血脂和膽固醇，使中性脂肪和血管中沉積的膽固醇乳化為對人體無害的微粒，溶于水中而排出體外，同時阻止多余脂肪在血管壁沉積，清掃血管，使血管循環(huán)順暢，被公認為“血管清道夫”。痰濁與血瘀證冠心病病人體內(nèi)均存在磷脂和氨基酸的代謝異常，其中磷脂影響到其他各類代謝，磷脂在體內(nèi)可經(jīng)各種磷脂酶作用水解為甘油、脂肪酸、磷酸和各種氨基醇(如膽堿、乙醇胺、絲氨酸等)；甘油可以轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫u丙酮，參加糖代謝；脂肪酸經(jīng)β-氧化作用而分解；磷酸是體內(nèi)各種物質(zhì)代謝不可缺少的物質(zhì)，各種氨基醇可以參加體內(nèi)磷脂的再合成，膽堿還可以通過轉(zhuǎn)甲基作用轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)。表明痰濁和血瘀具有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，這些物質(zhì)在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化和相互影響，驗證了痰、瘀作為津血代謝異常所化生的病理產(chǎn)物，同屬陰，是津血為病的兩個不同方面的表現(xiàn)形式，津血同源，痰瘀同源，痰瘀相關(guān)，痰瘀互化。本研究結(jié)果顯示痰濁和血瘀雖然有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，但同中有異，二者的特性差異代謝物有蘋果酸和琥珀酸、果糖和葡萄糖、非必須氨基酸甘氨酸和丙氨酸、不飽和脂肪酸棕櫚烯酸等。

不飽和脂肪酸是構(gòu)成體內(nèi)脂肪的一種必需脂肪酸，可保持細胞膜的相對流動性，以保證細胞的正常生理功能；降低血中膽固醇和三酰甘油；降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，提高腦細胞的活性，增強記憶力和思維能力。研究結(jié)果顯示Omega-3系列不飽和脂肪酸7，10-順十六碳二烯酸和DPA在痰濁組中降低，其余在血瘀組中濃度升高，表明冠心病痰濁和血瘀組病人均存在脂代謝紊亂，痰濁組具有更高的血脂水平、血液黏稠度，血管細胞膜受損程度相對嚴重。血瘀證病人不飽和脂肪酸含量增高的結(jié)果與國內(nèi)同行研究一致，可能與血瘀致心脈痹阻，心肌組織持續(xù)缺血、疼痛，造成生理應激，刺激腎上腺皮質(zhì)、激活交感神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，使血中糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺增高，致使機體分解代謝亢進，合成代謝降低，脂肪、糖原分解加快，血糖、脂肪酸水平會隨之增高[7]。

對于冠心病痰濁和血瘀證候的血清代謝組學研究表明，冠心病有特異性的代謝組特征，痰濁和血瘀既有特性差異性代謝物，也有共性代謝物，二者異中有同，同中有異，這對于提高冠心病“痰”“瘀”證的辨識能力具有重要意義，也為冠心病證候?qū)嵸|(zhì)的研究提供了客觀依據(jù)。痰濁和血瘀作為致病因子，有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，這與中醫(yī)理論的“痰瘀同源”“津血同源”是一致的，二者在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化，共同致病，亦即“痰瘀同病”，因而在治療冠心病時可以考慮痰瘀同治，提高療效。

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(本文編輯郭懷印)

Serum Metabonomics Analysis of Phlegm and Blood Stasis Syndrome in Patients with Coronary Heart Disease by Gas Chromatography-Mass Spectrometry Combined with Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Lu Xiaoyan，Gu Huan，Xu Hao，Zhao Tie，Li Geng

China Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the serum metabonomics characteristics of phlegm and blood stasis syndrome in patients with coronary heart disease(CHD).MethodsMetabolites spectral differences were compared between 102 patients with CHD (52 patients with phlegm syndrome and 51 with blood stasis syndrome) and 31 healthy individuals by analysis techniques of gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)，liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS) and pattern recognition technology.ResultsCHD group compared to healthy controls showed obvious difference in the metabolites including many kinds of amino acids，organic acids，long chain fatty acids，lysophospholipids，phospholipids，sphingomyelin；the most different metabolites also were common metabolites of phlegm and blood stasis group.The contents of organic acids，maltose，a variety of amino acids in CHD patients obviously increased than that in healthy control；while the contents of a variety of unsaturated fatty acids，derivatives，VitE，and cholesterol obviously decreased in CHD patients.Characteristic different metabolites in phlegm group and blood stasis group were mainly malic acid and succinic acid，fructose and glucose，glycine and alanine and palmitoleic acid.Among them，in phlegm group the contents of 7，10-Hexadecadienoic acid and DPA reduced，while the rest of them in blood stasis group increased.ConclusionCHD had specific metabolic group characteristics，phlegm and blood stasis had both characteristic different metabolites，also had common metabolites，which had important significance in improving identification ability of phlegm and blood stasis syndrome of coronary heart disease，also provided objective basis for CHD syndrome essence research.Phlegm and blood stasis had common material basis，which was coincident with Chinese medicine phlegm and blood stasis homologous theory.As pathogenic factors，both in the body could change into each other，and caused disease commonly，so treating phlegm and blood stasis simultaneously could improve curative effect.

Key words：coronary heart disease；metabnomics；phelgm syndrome；blood stasis syndrome；combination disease with syndrome

(收稿日期：2015-12-18)

Corresponding Author：Gu Huan

中圖分類號：R541.4R256.2

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.001

文章編號：1672-1349(2016)09-0929-04

通訊作者：顧煥，E-mail：deerxiaoyan@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.30901891)
作者單位：1.中日友好醫(yī)院(北京 100029)；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院

·臨床醫(yī)學論著·