寧明安　劉立鵬　陳書影　程康　瞿發(fā)林　郭文怡

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科

?

·臨床研究·

外周循環(huán)血微小RNA表達(dá)水平與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析

寧明安劉立鵬陳書影程康瞿發(fā)林郭文怡

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科

【摘要】目的探討微小RNA-133a(miRNA-133a)、miRNA-208a和miRNA-499a在冠心病患者外周循環(huán)血中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法選擇冠心病患者290例，冠狀動(dòng)脈陰性對(duì)照組110例，收集兩組樣本臨床資料；運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)樣本血漿中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平，并分析其表達(dá)差異。結(jié)果(1)與冠狀動(dòng)脈陰性對(duì)照組比較，冠心病組miRNA-133a[0.62(0.32-0.92)比0.39(0.21-0.72)，Z=8.80]、miRNA-208a[5.85(2.31-9.78)比5.06(2.17-9.13)，Z=2.32]和miRNA-499a[5.07(2.08-9.54)比3.12(1.96-5.03)，Z=10.08] 表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；(2)根據(jù)Gensini評(píng)分將所有研究對(duì)象分為4組，各組之間miRNA-133a[0.36(0.21-0.66)比0.48(0.36-0.85)比0.60(0.42-0.87)比0.70(0.56-0.92)，H=64.84]、miRNA-208a[4.99(2.17-6.73)比5.16(3.56-8.04)比5.85(4.31-8.63)比6.18(4.84-9.78)，H=21.54]和miRNA-499a[2.94(1.96-4.93)比3.55(2.02-6.63)比4.51(2.38-7.54)比6.24(4.08-9.54)，H=89.70]表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，且表達(dá)水平變化與Gensini評(píng)分即冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄程度呈正相關(guān)(miRNA-133a：r=0.343，P<0.01；miRNA-208a：r=0.395，P<0.01；miRNA-499a：r=0.410，P<0.01)。結(jié)論冠心病患者外周循環(huán)血中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平較冠狀動(dòng)脈陰性對(duì)照者有顯著差異，且表達(dá)水平變化與Gensini評(píng)分即冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄程度呈正相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】微小RNA；冠狀動(dòng)脈疾?。荒孓D(zhuǎn)錄；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)；Gensini評(píng)分

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類高度保守的內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA，幾乎存在于所有真核微生物中[1]。其可通過(guò)與特定靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)性結(jié)合促使其降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[2]。研究發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)血中存在miRNAs，作為調(diào)節(jié)因子在心臟發(fā)育、血管發(fā)育和血管再生中起著重要作用[3]。目前在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)約800種miRNAs，估計(jì)總共有超過(guò)1 000種miRNAs在人類基因組中表達(dá)[4]。而且miRNAs不易受溫度、pH值及放置時(shí)間長(zhǎng)短的影響，因此具有非常好的穩(wěn)定性[5]。miRNAs將可能作為一種新型的生物標(biāo)記物在冠心病患者的診斷和預(yù)后中發(fā)揮重要作用[6]，并且有望成為冠心病的一個(gè)新型治療靶點(diǎn)[7]。

冠心病是心血管疾病中的常見(jiàn)病，具有高發(fā)病率和高致死率的特點(diǎn)，已成為人群最主要的死亡病因[8]。因此，冠心病應(yīng)早期預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷，從而阻止該病進(jìn)行性發(fā)展，改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后，提高患者的治愈率和生存率。本研究旨在觀察冠心病患者血漿中miRNAs表達(dá)水平變化，探討其與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性，對(duì)早期診斷和預(yù)防冠心病具有重要意義，為進(jìn)一步探討冠心病的基因診斷和治療提供重要的理論依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

選取2014年12月至2015年5月于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科住院并行冠狀動(dòng)脈造影明確診斷為冠心病的患者290例作為病例組，年齡>18歲，無(wú)血緣關(guān)系，冠狀動(dòng)脈三支主要血管中，至少有一支狹窄程度≥50%[9]。同時(shí)選取基線資料配對(duì)的110例疑診冠心病患者，行冠狀動(dòng)脈造影后，冠狀動(dòng)脈三支主要血管的狹窄程度均<50%，能夠明確排除冠心病，作為對(duì)照組。記錄所有研究對(duì)象的完整病史信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)惡性腫瘤病史；(2)終末期腎臟疾病，肝功能衰竭；(3)1個(gè)月內(nèi)輸血史；(4)骨髓移植術(shù)史；(5)急性感染。本研究經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。所有研究方案均取得患者或家屬知情同意。

1.2研究方法

1.2.1病史資料收集所有研究對(duì)象的年齡、性別、身高、體重、吸煙史、飲酒史、既往高血壓和糖尿病病史等資料。

1.2.2生化檢查收集所有研究對(duì)象的采血檢測(cè)的生化檢查資料，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮、尿酸、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoproteincholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoproteincholesterol，LDL-C)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)。

1.2.3冠狀動(dòng)脈造影及Gensini評(píng)分[10]所有研究對(duì)象的冠狀動(dòng)脈造影均采用橈動(dòng)脈或股動(dòng)脈途徑進(jìn)行，術(shù)中盡量使冠狀動(dòng)脈各段能充分顯示。冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度采用Gensini評(píng)分，根據(jù)評(píng)分結(jié)果將所有研究對(duì)象分為4組：A組99例，Gensini評(píng)分≤22分，B組98例，Gensini評(píng)分23～55分，C組102例，Gensini評(píng)分56～96分，D組101例，Gensini評(píng)分≥97分。

1.2.4血液樣本的采集和儲(chǔ)存所有研究對(duì)象在胸痛發(fā)作24 h內(nèi)行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)前抽取橈動(dòng)脈血5 ml于含EDTA抗凝劑采血管中，靜置1 h，室溫1 200 rpm離心15 min，提取上清液分裝到去RNA酶的EP管中，再以8 000 rpm充分離心5 min，取上層血漿每500 μl分裝至RNAse-free EP管中，最終每例患者收集2～3管，然后放置到-80℃低溫冰箱中保存待用。

表1　兩組樣本基本臨床資料比較

1.2.5miRNAs檢測(cè)將離心得到的血漿取500 μl到新的離心管中，用RNAiso Plus(TaKaRa，Code No.9109)，按照試劑操作說(shuō)明提取各樣本總RNA，放置于-80℃低溫冰箱中保存集中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。各樣本均取20 ng總RNA應(yīng)用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，Code No.RR036A)，按照試劑操作說(shuō)明配制成10 μl體系的RT反應(yīng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。以RNU6B為內(nèi)參。各樣本逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均取2 μl應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，Code No.RR820A)，按照操作說(shuō)明配制成25 μl體系的PCR反應(yīng)液，使用ABI 7500儀應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和PCR雙重特異性引物擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a的Ct值。以RNU6B為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組樣本臨床資料及生化指標(biāo)比較

表1、2顯示，病例組和對(duì)照組的年齡、性別、體重、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、高血壓病史、糖尿病病史、FBG、水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與對(duì)照組比較，病例組的吸煙比以及TG、TC、LDL-C、肌酐和尿酸均顯著高于對(duì)照組，HDL-C水平低于對(duì)照組(均為P<0.01)。

表2　兩組樣本基本生化指標(biāo)比較

2.2根據(jù)Gensini評(píng)分分組的樣本間臨床資料及生化指標(biāo)比較

表3、4顯示，將所有研究對(duì)象根據(jù)Gensini評(píng)分按照四分位數(shù)間距分為4組，分析結(jié)果表明各組間年齡、性別、體重、BMI、高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史、FBG、HDL-C、肌酐和尿酸水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；各組間TG、TC和LDL-C的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

表3　根據(jù)Gensini評(píng)分分組的基本臨床資料比較

表4　根據(jù)Gensini評(píng)分分組的基本生化指標(biāo)比較

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量檢測(cè)miRNA結(jié)果

表5顯示，與對(duì)照組比較，病例組miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。結(jié)果以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。

表5　兩組樣本miRNA檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25-P75)]

表6顯示，將所有研究對(duì)象根據(jù)Gensini評(píng)分按照四分位數(shù)間距分組，分析結(jié)果表明各組間miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.4相關(guān)性分析

圖1、2、3顯示，Pearson直線相關(guān)分析表明，血漿中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，即表達(dá)水平變化與冠狀動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.343、0.395和0.410(均為P<0.01)。

3討論

目前發(fā)現(xiàn)與冠心病相關(guān)的miRNAs很多，其中研究較多的有miRNA-1、miRNA-126、miRNA-133、miRNA-208和miRNA-499等，這些血管內(nèi)皮特異性表達(dá)的miRNAs在冠心病患者表達(dá)水平異常，提示它們可能是冠心病的潛在生物標(biāo)志物，但尚未得出一致結(jié)論[11-15]。并且，此類miRNAs在外周循環(huán)血中的表達(dá)水平與冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度是否具有相關(guān)性尚不清楚。

表6　根據(jù)Gensini評(píng)分分組的miRNA檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25-P75)]

圖1　miRNA-133a與Gensini評(píng)分的關(guān)聯(lián)性分析

圖2　miRNA-208a與Gensini評(píng)分的關(guān)聯(lián)性分析

圖3　miRNA-499a與Gensini評(píng)分的關(guān)聯(lián)性分析

D′ Alessandra等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠冠狀動(dòng)脈閉塞6 h后心肌梗死區(qū)miRNA-1和miRNA-133的表達(dá)水平均下降；而在血清或血漿中檢測(cè)到的miRNA-1、miRNA-133和miRNA-499的表達(dá)水平則升高，表明miRNA-1和miRNA-133在心肌損傷后才釋放入血，并在心肌梗死患者出現(xiàn)癥狀后156 min即能檢測(cè)到miRNA-1和miRNA-133的高峰值，且此數(shù)值比cTnI峰值出現(xiàn)更早、數(shù)值更高。Eitel等[17]研究126例ST段抬高型心肌梗死患者，也發(fā)現(xiàn)血清或血漿中miRNA-133a表達(dá)水平的升高與心肌損傷修復(fù)、損傷面積擴(kuò)大和再灌注損傷密切相關(guān)。上述研究表明，血清或血漿miRNA-133可能是一種有意義的早期診斷急性心肌梗死的生物標(biāo)記物，對(duì)于早期接受再灌注治療挽救心肌有重要意義。

miRNA-499在肌肉中特異表達(dá)，在肌球蛋白基因調(diào)控中起重要作用。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，有6種miRNAs(miRNA-l、miRNA-134、miRNA-186、miRNA-208、miRNA-223和miRNA-499) 在急性心肌梗死患者血清或血漿中表達(dá)均明顯升高，且miRNA-208和miRNA-499在心絞痛患者中表達(dá)更高。這些提示miRNA-499也有作為生物標(biāo)記物診斷冠心病的潛力。

miRNA-208由α肌球蛋白重鏈(α-MHC)的內(nèi)含子編碼，特異性地表達(dá)于心肌組織[19]，其功能主要在心肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中調(diào)控肌球蛋白重鏈的生成。Xu等[20]通過(guò)靜脈注射異丙腎上腺素建立大鼠心肌缺血的動(dòng)物模型，再用miRNA微陣列分析得出miRNA-208是心臟特異性miRNA這一結(jié)果。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在大鼠還是人體內(nèi)，正常狀態(tài)下檢測(cè)不到miRNA-208a，且只有受損的心臟組織中才能檢測(cè)到miRNA-208a；此外，通過(guò)建立心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，發(fā)現(xiàn)心肌損傷1 h內(nèi)大鼠血漿miRNA-208a即會(huì)明顯升高，如果未損傷心肌而只損傷骨骼肌，則miRNA-208a不升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-208a在心肌梗死患者血清或血漿中明顯高于正常人以及其他患心血管疾病的患者，并且通過(guò)受試者工作特征曲線分析證實(shí)miRNA-208a具有很高的敏感性和特異性。上述結(jié)果表明，miRNA-208a具有高度的心肌特異性，提示miRNA-208a可能是一種有意義的早期診斷急性心肌梗死的生物標(biāo)志物。

本研究仍然存在一些不足。首先，本研究所選的3個(gè)miRNAs僅僅來(lái)源于國(guó)內(nèi)外相關(guān)參考文獻(xiàn)，研究為非探索性研究；其次，同所有病例-對(duì)照研究一樣，本研究存在一些不可避免的選擇偏倚；再次，此研究只包括了新診斷的急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者并且只在手術(shù)治療前采集了血液樣本，并且未對(duì)患者進(jìn)行隨訪。急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者從發(fā)病到確診的時(shí)間難以精確掌握，對(duì)于該部分患者的采血時(shí)間可能存在偏差；最后，本研究只入選了陜西漢族的冠心病人群。

4小結(jié)

本臨床研究以冠心病患者為研究對(duì)象，檢測(cè)其血漿中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)冠心病組血漿miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將所有研究對(duì)象根據(jù)Gensini評(píng)分按照四分位數(shù)間距分為4組，各組之間血漿miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且表達(dá)水平變化與Gensini評(píng)分即冠狀動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)。但是，冠心病是一種多種基因參與的多因素疾病，由于1種miRNA可能靶向多個(gè)基因，1種基因可能受多個(gè)miRNA的共同調(diào)控，因此miRNA在臨床診療冠心病方面的應(yīng)用仍需不斷研究、探索、嘗試，才能最終實(shí)現(xiàn)其臨床價(jià)值。

利益沖突：無(wú)

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(本文編輯：譚瀟)

Fund program：National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No.2012AA02A603)

Association between the expression of peripheral plasma microRNAs and the risk of coronary heart disease

NingMing′an，LiuLipeng，ChenShuying，ChengKang，QuFalin，GuoWenyi

DepartmentofCardiovascularMedicine，XijingHospital，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710032，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of peripheral plasma miRNA-133a，miRNA-208a and miRNA-499a in patients with coronary heart disease (CHD).Methods The 290 CHD patients and 110 controls subjects were enrolled in this study.Peripheral blood of all subjects and their clinical data were collected.Plasma miRNA-133a，miRNA-208a and miRNA-499a levels were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis and their expressions were furtherly analyzed.Results(1)Compared with control group，the expression of plasma miRNA-133a [0.62(0.32-0.92) vs.0.39(0.21-0.72)，Z=8.80]，miRNA-208a [5.85(2.31-9.78) vs.5.06(2.17-9.13)，Z=2.32] and miRNA-499a [5.07(2.08-9.54) vs.3.12(1.96-5.03)，Z=10.08] were significantly increased in CHD group (all P<0.01).(2)CHD patients were further divided into four groups according to Gensini score.The expression levels of plasma miRNA-133a [0.36(0.21-0.66) vs.0.48(0.36-0.85) vs.0.60(0.42-0.87) vs.0.70(0.56-0.92)，H=64.84]，miRNA-208a [4.99(2.17-6.73) vs.5.16(3.56-8.04) vs.5.85(4.31-8.63) vs.6.18(4.84-9.78)，H=21.54]，and miRNA-499a [2.94(1.96-4.93) vs.3.55(2.02-6.63) vs.4.51(2.38-7.54) vs.6.24(4.08-9.54)，H=89.70] were significantly difference among those groups (all P<0.01)，and positively correlated with severity of coronary artery stenosis (miRNA-133a: r=0.343，miRNA-208a: r=0.395，miRNA-499a: r=0.410，all P<0.01).ConclusionsThere is significant difference between CHD and control groups in the expressions of peripheral plasma miRNA-133a，miRNA-208a and miRNA-499a.In addition，the expression levels and Gensini Score-severity of coronary artery stenosis is positively correlated.

【Key words】MicroRNAs (miRNAs)；Coronary artery disease；Reverse transcription；Real-time quantitative polymerase chain reaction；Gensini score

(收稿日期:2016-03-16)

Corresponding author：Guo Wenyi，Email：guowenyi@tom.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA02A603)

DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2016.02.008

通訊作者：郭文怡，電子信箱：guowenyi@tom.com