黎先偉 譯

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藍耳病病毒（PRRSV）實驗室診斷所面臨的挑戰(zhàn)

By Katarzyna Podgórska

黎先偉 譯

自從1996年暴發(fā)以來，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（豬藍耳病病毒，PRRSv）感染的臨床表現(xiàn)越來越復(fù)雜多樣，而且現(xiàn)在的感染主要以多種病原混合感染為主，這使得我們難以通過剖檢和肉眼病變做出準(zhǔn)確的判斷，因此，對于豬藍耳病病毒（PRRSv）的診斷必須通過實驗室的分子生物學(xué)等檢測手段來進行核實。隨著技術(shù)的發(fā)展，豬藍耳病病毒（PRRSv）的實驗室診斷技術(shù)有了更多的選擇，不過目前最常用于豬藍耳病病毒（PRRSv）抗體和抗原的實驗室檢測分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。

如何選擇一個合適的診斷方法，取決于診斷的目標(biāo)。其中特異性高的診斷方法適用于監(jiān)測豬藍耳病病毒（PRRSv）陰性群體，而對公豬精液的檢測則需要在感染的早期階段采用敏感性極高的診斷方法。在制定和執(zhí)行豬藍耳病（PRRS）的防控計劃中，最好是采用ELISA 和RT-PCR相結(jié)合的方法，并進行DNA序列的分析，以全面的監(jiān)控豬場豬藍耳病病毒（PRRSv）的動態(tài)變化。每個養(yǎng)豬場都必須根據(jù)豬藍耳病病毒（PRRSv）的診斷目標(biāo)、豬場的規(guī)模和養(yǎng)殖模式來單獨地制定采樣計劃。簡單的來說，我們判斷一個豬場是否感染豬藍耳病病毒（PRRSv），一般可通過ELISA的方法檢測10至20份育肥豬的血清來回答。要想詳細(xì)分析一點飼養(yǎng)或多點飼養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)中豬藍耳病病毒（PRRSv）的循環(huán)（感染）狀態(tài)，那么則需要采集大量的具有代表性的不同日齡（包括保育豬、生長豬和育肥豬）的豬群，以及一個生長系統(tǒng)中所有不同位置的樣品，因為它們可能代表著一個獨立的病毒生態(tài)系統(tǒng)。

要想解釋血清轉(zhuǎn)換或在一個使用豬藍耳病活疫苗的養(yǎng)豬場中進行病毒的檢測具有一定的難度，這主要是因為（1）目前市場上沒有標(biāo)記疫苗；（2）疫苗毒會在使用活疫苗的養(yǎng)豬場內(nèi)長期存在；（3）至少在一段時間內(nèi)疫苗毒與野毒會在豬場內(nèi)共存。在這樣的養(yǎng)豬場中，對不同日齡的豬群檢測所獲的核酸進行DNA序列分析，以便更充分的認(rèn)識豬場內(nèi)豬藍耳病病毒（PRRSv）的循環(huán)（感染）狀態(tài)。

基于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）的血清學(xué)診斷方法操作起來十分簡便，而且具有較好的特異性和敏感性，適用于一個群體的基礎(chǔ)檢測。不過，個別的血清樣品，尤其是育肥豬有可能會出現(xiàn)假陽性的情況。這對于豬藍耳病病毒（PRRSv）陰性群體的監(jiān)測來說可能會造成一定的困擾，因此，對于這種情況需要采用不同的檢測方法來重新檢測樣品（包括免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、間接免疫熒光試驗（IFA）或另一些特異性更高的ELISA試驗）；或者2至3周后重新采集豬群樣品進行檢測。ELISA性能的這一方面很少解決診斷能力的評價。如果一個ELISA檢測試劑盒的敏感性較低的話一般可通過增加檢測樣品數(shù)來克服；不過其特異性較低的話則往往需要額外的工具來協(xié)助做出正確的診斷。

一般來說，任何一個ELISA檢測試劑盒通常只用于針對一種豬藍耳病病毒（PRRSv）基因型的抗體進行檢測，而這種只針對一種豬藍耳病病毒（PRRSv）基因型的抗原所研發(fā)的ELISA試劑盒通常對另一種基因型的豬藍耳病病毒（PRRSv）的敏感性較低。眾所周知，豬藍耳病病毒（PRRSv）主要分成兩種基本的基因型，即歐洲型和美洲型。目前，美洲型豬藍耳病病毒（PRRSv）是造成全球暴發(fā)高致病性豬藍耳病的主要基因型，美洲型的毒力要比歐洲型的更強。不過，隨著豬藍耳病病毒（PRRSv）的變異，歐洲型豬藍耳病病毒（PRRSv）在歐洲一些國家的發(fā)病率有所上升，而且造成較嚴(yán)重的臨床癥狀。陸續(xù)有報道在我國分離到歐洲型豬藍耳病病毒（PRRSv），這需要引起我們高度的重視。此外，目前也有試劑盒能夠?qū)煞N基因型病毒的血清轉(zhuǎn)化進行區(qū)分，不過需要注意的是，由于兩者之間只有很少的血清交叉反應(yīng)，因此用這種方法所獲的的結(jié)果需謹(jǐn)慎對待。從目前來說，人們普遍推薦采用辨別式PCR來對養(yǎng)豬場內(nèi)兩種不同基因型豬藍耳病病毒（PRRSv）的混合感染進行診斷。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測病毒核酸的原理是，針對豬藍耳病病毒（PRRSv）的一個特定的基因組片段設(shè)計一段可互補性結(jié)合的寡核苷酸（引物），并在特定條件下通過酶促反應(yīng)將微量的待測病毒成倍放大。目前，實驗室最為常用的檢測方法是實時定量PCR，其是通過監(jiān)測與特定序列結(jié)合的DNA探針?biāo)l(fā)出的信號，判斷待檢病毒的擴增情況?？紤]到這種反應(yīng)的特性，這樣的信號也可能出現(xiàn)在缺失的病毒序列中，特別在聚合酶鏈反應(yīng)的后期常有發(fā)生，這可能導(dǎo)致類似于弱陽性的結(jié)果。

然而，有關(guān)RT-PCR檢測方法所主要關(guān)注的問題是病毒較高的遺傳多樣性，這可能會導(dǎo)致核苷酸序列突變的累積（包括引物序列或探針結(jié)合部位），從而出現(xiàn)假陰性的情況。OIE參考實驗室對市場上的RT-PCR試劑盒進行比較分析（Podgorska et al.， 2015），結(jié)果表明一些商業(yè)化的RT-PCR試劑盒不能檢測出大多數(shù)基因1型的豬藍耳病病毒（PRRSv），這些病毒主要起源于東歐。由于源自東歐的基因1型豬藍耳病病毒（PRRSv）的有效序列十分有限，因此，目前這種方法使用的大多數(shù)引物和探針都是以基因2型和基因1型1亞型的經(jīng)典株為基礎(chǔ)，而2-4亞型的東歐毒株從遺傳角度來看具有較大的差異（Stadejek et al. 2013）。而且，相關(guān)研究已證實，其中一些東歐的豬藍耳病病毒（PRRSv）要比目前在西歐和中歐流行的毒株毒力更強，因此我們應(yīng)該對這種毒株給予更多的關(guān)注，以確保能夠早期檢測出它們向外蔓延的情況。

到目前為止，沒有任何一種RT-PCR的檢測方法可推薦作為一種通用的檢測方法，以用于檢測所有的豬藍耳病病毒（PRRSv）且具有最佳的靈敏度。總的來說，上述的內(nèi)容強調(diào)了，對于目前豬藍耳病病毒（PRRSv）的流行毒株來說，全面評估目前使用的檢測方法及其不斷重新驗證的必要性。對此，豬藍耳病（PRRS）參考實驗室已開始盡可能多的收集具有代表性的豬藍耳病病毒（PRRSv），以覆蓋病毒的遺傳多樣性，這是這些參考實驗室目前最重要的工作之一，從而更全面的監(jiān)測和了解豬藍耳病病毒（PRRSv）的流行動態(tài)和變異情況。

備注：

1）抗體的檢測

ELISA：

結(jié)果呈陽性：（1）感染豬藍耳病病毒（疫苗毒或野毒）；（2）母源抗體（持續(xù)3至5周），未感染豬藍耳病病毒；（3）非特異性抗體與檢測板上的抗原相結(jié)合，為感染豬藍耳病病毒；（4）外源性的豬藍耳病病毒抗體（僅唾液）。

結(jié)果呈陰性：（1）未感染豬藍耳病病毒；（2）剛感染豬藍耳病病毒，但抗體尚未產(chǎn)生（小于9天）；（3）抗體的含量很低未能檢測出；（4）感染期結(jié)束，呈血清反應(yīng)陰性；（5）持續(xù)感染豬群，但呈血清反應(yīng)陰性；（6）對非常特異的病毒株所產(chǎn)生的抗體檢測失敗。

2）抗原的檢測

PCR：

結(jié)果呈陽性：（1）感染豬藍耳病病毒（疫苗毒或野毒）；（2）存在非傳染性病毒感染；（3）樣品污染，豬群未感染病毒。

結(jié)果呈陰性：（1）不存在病毒RNA；（2）病毒的含量很低未能檢測出；（3）樣品降解不能檢出病毒；（4）引物或探針不匹配不能檢出病毒；（5）樣品中檢測不到病毒RNA，但豬群持續(xù)感染病毒；（6）樣品中檢測不到病毒RNA，但豬群呈隱形帶毒感染。