胡　娜　孟凡旭　于鵬躍　劉　念　張　奇　劉林林

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林　長春　130041)

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前列腺酸性磷酸酶負(fù)載的樹突細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞過繼免疫治療晚期激素難治性前列腺癌的臨床研究

胡娜孟凡旭1于鵬躍2劉念3張奇劉林林

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林長春130041)

〔摘要〕目的探討前列腺酸性磷酸酶(PAP)負(fù)載的樹突細(xì)胞(DC)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(CIK)對晚期激素難治性前列腺癌(HRPC)患者的臨床療效。方法回顧性研究吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤生物治療中心2009年4月至2013年2月收治的32例診斷明確且不再適宜手術(shù)或放化療的晚期HRPC患者，隨機分成兩組：對照組16例，接受前列腺癌細(xì)胞系裂解物致敏DC聯(lián)合CIK過繼免疫；實驗組16例，接受PAP-DC聯(lián)合CIK過繼免疫治療，記錄兩組患者的臨床療效。結(jié)果兩組患者治療中均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，晚期HRPC患者對DC聯(lián)合CIK治療的耐受良好。兩組患者治療后外周血T淋巴細(xì)胞亞群較治療前增高，但并無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；兩組治療后1 w血清前列腺特異性抗原(PSA)值有所升高，治療后1個月PSA值下降，且較治療前有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；短期療效評價：實驗組3例部分緩解(PR)、9例疾病穩(wěn)定(SD)、4例疾病進展(PD)，對照組2例PR、8例SD、6例PD，實驗組的客觀緩解率(ORR)高于對照組(P<0.05)?；颊咧委熀篌w力狀況(KPS評分)改善，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異；兩組總生存期(OS)無統(tǒng)計學(xué)意義，而兩組中位疾病進展時間(mTTP)差異顯著(P<0.05)，實驗組無進展生存期(PFS)優(yōu)于對照組(P<0.05)。結(jié)論PAP負(fù)載DC聯(lián)合CIK過繼免疫治療晚期HRPC患者的臨床療效不劣于前列腺癌細(xì)胞裂解物負(fù)載的DC-CIK免疫治療，使患者無病生存獲益，具有較好的臨床應(yīng)用價值。

〔關(guān)鍵詞〕前列腺酸性磷酸酶；前列腺癌細(xì)胞系裂解物；樹突細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；激素難治性前列腺癌

前列腺癌幾年內(nèi)幾乎均進展至激素難治性前列腺癌(HRPC)階段〔1〕。近年來，多項研究顯示免疫治療對前列腺癌有較好的療效，其中大多數(shù)是基于樹突細(xì)胞(DC)疫苗的治療〔2〕。本研究采用特異性前列腺酸性磷酸酶(PAP)致敏的DC細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)過繼免疫治療晚期HRPC患者，與前列腺癌細(xì)胞系裂解物致敏DC聯(lián)合CIK過繼免疫治療對照，并對其免疫反應(yīng)性、特異性腫瘤標(biāo)志物細(xì)胞(PSA)、客觀緩解率、生活質(zhì)量、生存時間和安全性進行回顧性總結(jié)，旨在證明此PAP負(fù)載DC-CIK過繼免疫治療晚期HRPC患者的臨床療效不劣于前列腺癌細(xì)胞裂解物負(fù)載的DC-CIK免疫治療。

1材料與方法

1.1研究對象選擇2009年4月至2013年2月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤生物治療中心收治的32例晚期HRPC患者，且滿足以下條件：患者卡氏功能狀態(tài)評分(KPS)≥60分(預(yù)期生存>3個月)；同時患者造血功能及心、肝、腦、腎等重要器官功能正常，排除其他系統(tǒng)和器官惡性腫瘤、自身免疫性疾病。隨機分成兩組，對照組16例，接受前列腺癌細(xì)胞系裂解物致敏DC聯(lián)合CIK過繼免疫，平均年齡(74.1±10.3)歲，侵襲或轉(zhuǎn)移鄰近器官4例，盆腔淋巴結(jié)1例，骨15例，盆腔外轉(zhuǎn)移2例，KPS評分(68.75±8.85)分，PSA(54.02±44.47)ng/ml；實驗組16例，接受PAP-DC聯(lián)合CIK過繼免疫治療，平均年齡(72.9±12.8)歲，侵襲或轉(zhuǎn)移鄰近器官3例，盆腔淋巴結(jié)2例，骨13例，盆腔外轉(zhuǎn)移2例，KPS評分(71.25±9.57)分，PSA(53.31±41.47)ng/ml。兩組患者各項指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義。DC聯(lián)合CIK免疫治療的方法和程序經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其法定代理人知情并簽署治療同意書。

1.2主要儀器和材料血細(xì)胞分離機(德國Kabi Fresenius公司)，F(xiàn)C500流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)，酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀(美國Themro公司)，F(xiàn)icoll-Hypaque(美國Gibco公司)，RPMI1640(PAA laboratories GmbH Linz Austria)，AIM-V invitrogene培養(yǎng)液，rhGM-CSF、rhIL-4、腫瘤壞死因子(TNF)-α，CD3單抗，內(nèi)毒素檢測試劑盒。前列腺酸性磷酸酶多肽序列由英國蘇格蘭高地島嶼大學(xué)(UHI)設(shè)計與合成。

1.3治療方法

1.3.1自身前列腺癌細(xì)胞的分離和抗原制備經(jīng)穿刺活檢獲得對照組患者少量前列腺癌組織，用生理鹽水(含青霉素鈉、鏈霉素各100 U/ml)洗滌，研磨成勻漿，采用淋巴細(xì)胞分離液分離后獲得自身癌細(xì)胞，加入RPMI1640液后行原代培養(yǎng)與擴增，滿足治療需求后反復(fù)凍融，再經(jīng)超聲波破碎裂解，離心并吸取上清液，經(jīng)濾膜除菌后作為腫瘤抗原備用，同時行蛋白定量檢測。

1.3.2DC細(xì)胞的制備及致敏采用血細(xì)胞分離機采集患者外周血單個核細(xì)胞，獲取1～3×109個單核細(xì)胞及血漿50 ml。經(jīng)Ficoll-Hypaque分離單個核細(xì)胞后，離心洗滌2次，用RPM1640無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后獲得貼壁細(xì)胞，加入含1 000 U/ml rhGM-CSF、50 ng/ml rhIL-4的無血清AIM-V培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；第3天進行1/3換液，同時補充上訴細(xì)胞因子；第5天加入自身癌細(xì)胞抗原或PAP多肽(終質(zhì)量濃度為20 μg/ml)，誘導(dǎo)培養(yǎng)12～16 h，加入TNF-α(500 U/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；第8天收集細(xì)胞，離心，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，經(jīng)靜脈回輸患者。

1.3.3CIK細(xì)胞的制備將分離的單核細(xì)胞重懸于AIM-V無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/L，接種到10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入γ-干擾素(IFN-γ)(1 000 U/ml)，輕搖混勻后，放入37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；次日加入CD3抗體激活殺傷細(xì)胞(CD3McAb，50 ng/ml)，IL-2(300 U/ml)，IL-1(100 U/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔3 d半量換液1次，同時補充上述因子；第8～9天收集CIK細(xì)胞，離心，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，經(jīng)靜脈回輸患者。

1.3.4致敏DC聯(lián)合CIK的細(xì)胞回輸培養(yǎng)7 d，DC和CIK進行內(nèi)毒素和無菌檢測合格后，于第8～16天(分8～9 d)將致敏DC、CIK輪流回輸患者，致敏DC和CIK每次回輸細(xì)胞量分別約為(0.5～1.0)×109與(0.2～1.0)×109?；剌敾颊咔凹∪庾⑸洚惐?5 mg預(yù)防過敏反應(yīng)，30 min內(nèi)輸注完畢。輸注細(xì)胞過程中密切監(jiān)測患者(體溫、心率、呼吸和血壓變化)生命體征，隨訪48 h觀察患者的短期不良反應(yīng)。不良事件依據(jù)常見不良反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE)3.0版記錄。

1.4免疫指標(biāo)分別于治療前與治療后1 w采集兩組患者的外周血，進行熒光標(biāo)記后采用FC500流式細(xì)胞儀行T淋巴細(xì)胞亞群的檢測。

1.5療效評估記錄兩組患者治療前后KPS評分分別于治療前、治療后檢測PSA值。所有患者隨訪2年，記錄總生存期(OS)、無進展生存期(PFS)。短期療效評價：治療3個月后行客觀緩解率(ORR)評價，全身骨顯像和盆腔MR等作為評價疾病狀態(tài)的指標(biāo)，療效評價按實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)進行。ORR率=完全緩解(CR)+部分緩解(PR)+疾病穩(wěn)定(SD)/總例數(shù)×100%。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1治療前后兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化治療后兩組患者的T淋巴細(xì)胞亞群有增高趨勢，其中實驗組總T淋巴細(xì)胞(CD3+)、對照組T輔助細(xì)胞(CD3+/CD4+)較治療前增高幅度較明顯(P<0.05)，但兩組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組自然殺傷(NK)T細(xì)胞與NK細(xì)胞無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1兩組患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群表型變化(x±s，n=16)

指標(biāo)對照組治療前治療后實驗組治療前治療后CD3+(%)53.26±11.2756.99±13.7155.04±12.2859.07±15.881)CD3+/CD4+30.71±11.4636.51±11.551)33.21±10.3138.86±15.88CD3+/CD8+21.01±9.4223.19±9.6117.91±7.4518.91±10.06CD4+/CD8+1.83±0.441.94±0.482.27±0.562.75±0.68NKT細(xì)胞(%)3.89±0.964.95±1.223.15±0.763.53±0.84NK細(xì)胞(%)19.73±10.8821.21±10.5224.50±13.1121.13±17.34

與治療前比較：1)P<0.05

2.2KPS評分及血清PSA水平治療后對照組和觀察組患者KPS評分〔(78.13±8.34)分，(80.63±7.72)分〕較治療前〔(68.75±8.85)分，(71.25±9.57)分〕改善，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。兩組患者治療后1 w的PSA值有所升高，治療后1個月的PSA值下降，且較治療前有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

2.3不良事件及耐受性評估兩組治療后疲倦乏力、骨痛、食欲不振等癥狀明顯改善?；颊咻斪⒓?xì)胞過程中，密切監(jiān)測患者生命體征，同時隨訪48 h觀察患者的短期不良反應(yīng)，監(jiān)測及隨訪內(nèi)容包括變態(tài)反應(yīng)、全身癥狀、肝腎功能、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等?；颊叱霈F(xiàn)短暫發(fā)熱伴一過性寒戰(zhàn)(≤39.5℃)、皮疹、轉(zhuǎn)氨酶升高，經(jīng)退熱、脫敏、保肝降酶等對癥治療后恢復(fù)正常；其他患者未出現(xiàn)不良事件。其中對照組發(fā)熱、皮疹各1例(6.25%)，肝功異常2例(12.5%)，實驗組發(fā)熱2例(12.5%)，皮疹1例(6.25%)。肝功異常3例(18.75%)。

2.4短期療效評價對照組0例CR、2例PR、8例SD、6例疾病進展(PD)，實驗組0例CR、3例PR、9例SD、4例PD，實驗組的ORR(75%)高于對照組(62.6%)。兩組OS無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而實驗組中位疾病進展時間(mTTP)較對照組延長(11.4個月vs 8.1個月)。見圖2。

圖1　兩組PSA水平的變化

圖2　兩組之間對于OS的生存分析

3討論

大多數(shù)的腫瘤疫苗是依據(jù)其和人類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的結(jié)合力設(shè)計的。含有8～10個氨基酸的單一勝肽抗原決定子可以和DC上的第一型(MHCⅠ)結(jié)合而引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的反應(yīng)，而和MHCⅡ結(jié)合的多肽類抗原決定子可以活化輔助T細(xì)胞，以協(xié)助CTL反應(yīng)和抗體產(chǎn)生。由于活化后的輔助T細(xì)胞可以協(xié)助活化記憶T細(xì)胞，因此和MHCⅡ相關(guān)的腫瘤疫苗可以有效地防止癌癥在治療后再復(fù)發(fā)。

PSA由腺上皮分泌到前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)，其周圍有血-上皮屏障，避免了上皮細(xì)胞產(chǎn)生的PSA直接分泌到血液中，從而維持了血液中PSA的低濃度。前列腺癌侵襲性原因破壞了該屏障時，致使PSA直接進入血液內(nèi)，從而導(dǎo)致血液中PSA的升高。該研究免疫治療后最初的PSA峰值的產(chǎn)生可能是免疫功能增強的原因，這在其他多項研究中也有發(fā)現(xiàn)〔3〕。本研究中兩組OS無統(tǒng)計學(xué)意義，有可能與隨訪時間較短有關(guān)。而兩組之間mTTP存在差異，相較于HRPC患者多西他賽單藥化療的中位進展時間6～7個月〔2，4〕及對照組前列腺癌細(xì)胞系裂解物抗原負(fù)載DC聯(lián)合CIK免疫治療的中位進展時間8.1個月，分別延長了4.4～5.4個月和3.3個月的無病生存期。治療后的短期療效評價提示特異性PAP抗原負(fù)載DC聯(lián)合CIK免疫治療對病灶的殺滅作用及防止其復(fù)發(fā)較對照組存在優(yōu)勢。實驗組MHCⅡ分子專一性結(jié)合的PAP多肽，不僅可以活化輔助T細(xì)胞、協(xié)助CTL的反應(yīng)和抗體的產(chǎn)生，同時可以協(xié)助活化記憶T細(xì)胞，可不受限于免疫系統(tǒng)耐受性、又能夠針對多種不同癌細(xì)胞進行毒殺攻擊作用，是可以防止癌癥復(fù)發(fā)的腫瘤疫苗。

此特異性PAP多肽疫苗負(fù)載的DC聯(lián)合CIK治療是安全的，在體內(nèi)能激發(fā)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，與自身癌細(xì)胞裂解物無明顯差異；同時可以協(xié)助活化記憶T細(xì)胞，防止癌癥復(fù)發(fā)。該疫苗可作為晚期HRPC患者的一種有效姑息性治療，使患者長期帶瘤生存，提高生存質(zhì)量；其特異性協(xié)助活化記憶T細(xì)胞功能可以防止腫瘤復(fù)發(fā)，延長患者無病生存期；對于非晚期患者，可以配合手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌治療等傳統(tǒng)治療，在腫瘤負(fù)荷降低后進一步清除散在癌細(xì)胞，減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，緩解毒副反應(yīng)，提高療效〔5〕。本研究樣本量小，體內(nèi)分子機制、治療評估方案的優(yōu)化及樣本數(shù)量的擴大等問題還需進一步研究。

4參考文獻

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〔2015-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R737.25

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1893-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.049

通訊作者：劉林林(1970-)，女，博士，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放射治療、化療及生物治療等研究。

基金項目：吉林省科技廳資助項目(20130413042GH)

1吉林省腫瘤醫(yī)院放療科2吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科

3吉林大學(xué)第一醫(yī)院

第一作者：胡娜(1990-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤放射治療的研究。