李志祥　錢　軍　張立功

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,安徽　蚌埠　233000)

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hGITRL在食道癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李志祥錢軍張立功

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,安徽蚌埠233000)

〔摘要〕目的探討食道癌的腫瘤壞死因子受體配體(hGITRL)表達(dá)差異的臨床病理相關(guān)性及其在預(yù)測(cè)患者預(yù)后中的臨床指導(dǎo)價(jià)值。方法采用Western印跡方法檢測(cè)112例食道癌臨床組織樣本和101例配對(duì)癌旁食道hGITRL的蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)38例食道癌患者、12例食道異常增生患者和20例健康自愿者的血清hGITRL蛋白水平，分層分析與食道癌病理參數(shù)的相關(guān)性，進(jìn)一步生存分析hGITRL表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果食道癌組織中hGITRL蛋白條帶灰度值較癌旁食道組織顯著增高(P<0.001)，且血清hGITRL陽性率為食道癌>食道異常增生>正常食道(P<0.05)；食道癌hGITRL的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)(P<0.001)；進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)hGITRL陽性表達(dá)者的3年、5年無瘤生存率和生存期，均較陰性者明顯降低(P<0.05)，Cox生存風(fēng)險(xiǎn)模型示hGITRL可能是食道癌患者3年無瘤生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.029，<0.05)。結(jié)論hGITRL可能成為食道癌早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，且可能具有預(yù)測(cè)食道癌患者3年無瘤生存預(yù)后的重要臨床價(jià)值，但尚待大樣本臨床研究證實(shí)。

〔關(guān)鍵詞〕hGITRL；食道癌；早期診斷；預(yù)后

目前認(rèn)為食管癌發(fā)生與多因素、多階段和多基因變異及其相互作用密切相關(guān)，其中分子水平上的癌基因、抑癌基因及其蛋白質(zhì)變化尤為重要〔1〕。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(TNF)受體(GITR)及其配體(GITRL)是最近發(fā)現(xiàn)的TNF受體/配體超家族成員之一，主要對(duì)調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)，hGITRL主要高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞表面，而靜息性和活化的T細(xì)胞不表達(dá)〔2〕。在對(duì)hGITRL突變體的功能研究中發(fā)現(xiàn)突變除了會(huì)影響GITRL與GITR的結(jié)合外，還影響了T細(xì)胞增殖〔3〕。也有研究發(fā)現(xiàn)了GITRL基因多態(tài)性與消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系〔4〕。最近報(bào)道提示GITRL可能作為一種致癌基因，參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生過程〔5〕。由于目前尚無hGITRL基因與食道癌發(fā)生發(fā)展的研究報(bào)道，本研究旨在探討hGITRL表達(dá)在食道癌發(fā)生發(fā)展、臨床病理及其預(yù)后方面的臨床意義。

1資料和方法

1.1臨床資料收集本院2008年2月至2013年1月接受食道癌根治術(shù)的患者112例，并成功獲得相應(yīng)配對(duì)的癌旁食道組織101例；同時(shí)獲得38例食道癌、12例食道異常增生(男7例，女5例，≥60歲5例，<60歲7例)和20例正常健康自愿者(男11例，女9例，≥60歲6例，<60歲14例)的外周血血清樣本；所有食道癌患者均經(jīng)術(shù)后病理組織外科檢查確診，食道異常增生患者經(jīng)胃鏡鉗取和病檢確診；納入患者卡氏功能狀況評(píng)估量表(KPS)均在60～80分之間。五組樣本的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床病理參數(shù)等資料詳見表1。本研究納入患者均簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2Western印跡檢測(cè)從食道癌根治術(shù)中獲得的食道癌和癌旁組織樣本放入凍存管并于液氮中保存，取出后液氮研磨，最后將RIPA蛋白裂解液處理后離心獲得的上清液移入EP管中待蛋白濃度測(cè)定。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析不同臨床樣本的蛋白質(zhì)濃度，并將蛋白濃度調(diào)至一致后等量加入聚丙烯酰胺漿凝膠電泳(PAGE)膠點(diǎn)樣孔中，指示線跑至底部時(shí)終止電泳，組裝轉(zhuǎn)膜三明治并放入轉(zhuǎn)膜儀中，在100V、100 min后終止轉(zhuǎn)膜，洗膜后5%脫脂牛奶封閉膜(搖床1 h)，隨后加入一抗4℃孵育過夜(β-actin 1∶1 000：購于聯(lián)科生物有限公司；hGITRL 1∶2 000：購于abcam公司)，復(fù)溫30 min后洗膜，再加入用5%脫脂牛奶稀釋的二抗孵育，室溫1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光處理，并采用凝膠圖像分析儀曝光和圖像保存。最終條帶灰度值采用image J軟件進(jìn)行分析。

表1各組樣本的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床資料(n)

項(xiàng)目食道癌組織(n=112)癌旁食道組織(n=101)食道癌血清(n=38)性別(男/女)68/4460/4121/17年齡(歲)≥60625520<60504618腫瘤部位上段29258中段444018下段393612病理類型鱗癌1029235腺癌1093分化程度高-中635921中-低494217淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有585419無544719臨床分期Ⅰ～Ⅱ期534516Ⅲ～Ⅳ期595622

1.3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)0.05 mol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至1～10 μg/ml，每一反應(yīng)孔加0.1 ml且4℃過夜，而后棄去孔內(nèi)液體，洗滌緩沖液洗3 min，共3次；加待檢樣品0.1 ml于已包被反應(yīng)孔中，37℃孵育60 min后洗滌；于各反應(yīng)孔中加酶標(biāo)抗體0.1 ml。37℃孵育30～60 min后洗滌；于各反應(yīng)孔中加TMB底物溶液0.1 ml以顯色，37℃孵育10～30 min；于各反應(yīng)孔中加2 mol/L硫酸0.05 ml終止顯色反應(yīng)；于450 nm波長(zhǎng)處在ELISA檢測(cè)儀上進(jìn)行各反應(yīng)孔的OD值測(cè)定，若大于陰性對(duì)照OD值的2.1倍或以上，即視為蛋白表達(dá)陽性。

1.4隨訪本研究納入的112例食道癌患者均參加了3年及5年的無瘤生存預(yù)后監(jiān)測(cè)，無失訪者，隨訪率達(dá)100%，隨訪包括術(shù)后和(或)輔助治療后3年和5年的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡等情況發(fā)生情況，并均記為終點(diǎn)事件，隨訪以門診或電話聯(lián)系等方式為主。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或ANOVA方差分析、χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier壽命表法并繪制生存曲線，用Log-rank檢驗(yàn)和Cox生存風(fēng)險(xiǎn)模型。

2結(jié)果

2.1食道癌組織中的hGITRL蛋白高表達(dá)食道癌組織中的hGITRL蛋白表達(dá)條帶灰度值為(210.66±74.32)，較癌旁食道組織的(104.29±55.85)顯著增高(t=11.707，P=0.000)。

2.2不同血清樣本的hGITRL蛋白陽性率比較食道癌患者血清中hGITRL陽性率為89.5%(34/38)，食道異常增生患者陽性率為58.3%(7/12)，健康自愿者陽性率為15.0%(3/20)，

三組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=31.256，P=0.000)，且兩兩比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3hGITRL表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性將112例食道癌患者的蛋白條帶灰度值的均值210.66設(shè)為臨界值，所有≥此值的視為陽性表達(dá)者，余下則為陰性表達(dá)者。結(jié)果顯示食道癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期與hGITRL表達(dá)密切相關(guān)(均P=0.000)，見表2。

表2食道癌hGITRL蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

項(xiàng)目hGITRL陽性(n=58)hGITRL陰性(n=54)P值性別男36320.761女2222年齡≥6029330.237<602921腫瘤部位上段14150.692中段2519下段1920病理類型鱗癌50520.061腺癌82分化程度高-中34290.600中-低2425淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有4018<0.001無1836臨床分期Ⅰ～Ⅱ期1637<0.001Ⅲ～Ⅳ期4217

2.4hGITRL陽性表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系hGITRL陽性表達(dá)者的3年無瘤生存期和生存率分別為(30.6±1.3)個(gè)月和74.1%，明顯低于hGITRL陰性者的(34.4±0.8)個(gè)月和90.7%(P=0.020)；同時(shí)，hGITRL陽性者5年無瘤生存期和生存率分別為(46.9±2.6)個(gè)月和65.5%，明顯低于hGITRL陰性者的(55.1±1.7)個(gè)月和81.5%(P=0.041)，見圖1、圖2；進(jìn)一步采用Cox生存風(fēng)險(xiǎn)模型分析發(fā)現(xiàn)hGITRL蛋白表達(dá)與食道癌患者3年無瘤生存密切相關(guān)(P=0.029；RR=1.504；95%CI：1.045～2.401)，但未發(fā)現(xiàn)與5年無瘤生存明顯相關(guān)。見表3，表4。

圖1　 hGITRL陽性者和陰性者的3年無瘤生存曲線比較

影響因素β值Waldχ2值P值RRRR95%CI年齡-0.3850.1820.6270.5390.084～2.886性別0.2800.8160.3661.4230.621～2.428腫瘤部位-0.2811.4550.2180.7580.278～1.292病理類型0.4140.6570.3841.5010.681～3.747分化程度-0.5181.4320.2340.5960.155～1.291淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-0.4553.2690.1721.6350.771～2.234臨床分期0.2730.7160.0860.7230.321～1.928hGITRL-1.4432.7890.0291.5041.045～2.401

表4食道癌患者5年無瘤生存影響因素的Cox分析

影響因素β值Waldχ2值P值RRRR95%CI年齡-0.1850.2510.6260.5310.093～3.204性別-0.3620.3190.5280.8770.313～3.497腫瘤部位-0.9890.5810.4130.4150.176～2.481病理類型-2.8392.3550.1771.2550.478～3.279分化程度0.4380.5570.4120.5010.221～2.747淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-2.1282.4320.1941.2960.535～2.831臨床分期1.8721.0670.1010.9180.150～1.981hGITRL-3.1604.1190.0611.2140.747～2.412

圖2　hGITRL陽性者和陰性者的5年無瘤生存曲線比較

3討論

作為最為常見的惡性腫瘤之一，食道癌發(fā)生具有顯著性地域差異，且普遍認(rèn)為吸煙和酒精過度攝入是鱗癌發(fā)生的高危因素，而Barrett食管是腺癌高危因素，兩種病理類型腫瘤均存在較高的等位基因缺失率，約為36%～75%〔6〕。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與食道癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因包括p53、MTS、APC和MCC等〔1〕。由于惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與的多階段和多基因相互作用的復(fù)雜過程，所以除了癌基因和抑癌基因的變異參與外，特異性蛋白在分子水平上的不同調(diào)控變化也可能是食道癌發(fā)生和發(fā)展的重要因素〔1〕。本研究發(fā)現(xiàn)hGITRL可高表達(dá)于一些腫瘤細(xì)胞表面〔3〕。再者，有研究發(fā)現(xiàn)GITRL蛋白在結(jié)直腸癌患者中有明顯表達(dá)增高，提示了GITRL可能與消化道惡性腫瘤的發(fā)病相關(guān)〔5〕，同時(shí)也有報(bào)道示GITRL的基因多態(tài)性與消化道惡性腫瘤存在相互關(guān)系〔4〕。本研究提示了hGITRL蛋白可能在消化道腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的重要作用，可作為一個(gè)候選癌基因及治療靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。本研究提示了hGITPRL成為生物學(xué)標(biāo)志物的可能，且我們還發(fā)現(xiàn)hGITRL蛋白在食道異常增生患者和正常人中也同時(shí)存在顯著性差異，從而可能揭示了hGITRL參與了食道癌早期發(fā)生過程，為其成為早期診斷標(biāo)志物提供了一定理論依據(jù)〔7〕，目前已有研究證明在hGITRL發(fā)生結(jié)構(gòu)誘變后，其突變型可以影響T細(xì)胞的增殖能力〔3〕，但尚待大樣本、多中心臨床研究和基礎(chǔ)研究進(jìn)一步明確。另外hGITRL可能同時(shí)參與了食道癌的惡性進(jìn)程〔8〕，且目前尚缺乏基礎(chǔ)研究證實(shí)這一推論。并且我們?cè)陔S訪分析中發(fā)現(xiàn)，hGITRL尚可能只能作為食道癌3年無瘤生存的預(yù)后預(yù)測(cè)分子，至于5年無瘤生存和總生存預(yù)后尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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〔2015-05-09修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號(hào)〕R735.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)08-1882-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.044

第一作者：李志祥(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺甲狀腺腫瘤的研究。