尹遜天　王　巍　朱玉峰　白　光

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧　錦州　121000)

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枸杞多糖對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管形成的影響

尹遜天王巍朱玉峰白光

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的觀察枸杞多糖(LBP)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移能力及血管形成的影響。方法在HUVECs分別加入不同濃度的LBP后，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)和劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)對(duì)HUVECS增殖與遷移的影響。利用基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)濃度LBP對(duì)血管形成作用的影響。結(jié)果①M(fèi)TT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨LBP濃度增加，抑制HUVECs增殖能力增強(qiáng)，同時(shí)應(yīng)用甩片實(shí)驗(yàn)可推斷LBP通過(guò)促進(jìn)HUVECs凋亡而達(dá)到抑制細(xì)胞增長(zhǎng)的作用；②劃痕實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)濃度LBP作用下HUVECs遷移距離較空白對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；③實(shí)驗(yàn)濃度LBP可明顯抑制血管形成。結(jié)論LBP對(duì)HUVECs增殖遷移及血管生成能力具有明顯抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕枸杞多糖；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；遷移；血管形成

腫瘤血管生成是所有實(shí)體腫瘤的共同特征，是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須依賴(lài)的病理學(xué)基礎(chǔ)，與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系極為密切。因此抗血管生成靶向治療已經(jīng)成為腫瘤治療的重要策略，本文觀察枸杞多糖(LBP)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖和遷移作用的影響，并檢測(cè)LBP對(duì)血管形成的影響。

1資料與方法

1.1一般資料2013年3月至2014年1月我院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室完成。HUVECs由我院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室提供，LBP含量35%，由上海康舟真菌多糖有限公司生產(chǎn)，胰蛋白酶〔含乙二胺四乙酸(EDTA)〕、二甲基亞砜(DMSO)由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，優(yōu)級(jí)胎牛血清由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)，DMEM高糖型培養(yǎng)基由美國(guó) Hyclone公司生產(chǎn)，噻唑藍(lán)(MTT)由美國(guó)Genview 公司生產(chǎn)。

1.2HUVECs培養(yǎng)方法由37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中取出T25培養(yǎng)瓶，倒置相差顯微鏡下見(jiàn)HUVECs貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，平鋪培養(yǎng)瓶底部，未見(jiàn)細(xì)胞重疊現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)細(xì)胞瓶壁80%～90%時(shí)，出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，進(jìn)行細(xì)胞傳代。具體如下：①將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液倒掉，用5 ml移液槍將瓶?jī)?nèi)剩余培養(yǎng)液吸出，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2～3遍，動(dòng)作輕柔，加入0.25%胰蛋白酶消化液3 ml，以胰酶鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部為準(zhǔn)，放回孵育箱中，消化1 min；倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞回縮、變圓，細(xì)胞間隙變寬，少數(shù)貼壁細(xì)胞懸浮，隨后加入3 ml DMEM高糖培養(yǎng)液終止胰酶消化，同時(shí)用5 ml移液槍反復(fù)吹打瓶壁，倒置相差顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞均無(wú)貼壁，呈單個(gè)漂浮培養(yǎng)液；②將細(xì)胞懸液移入15 ml離心管中，1 200 r/min，離心3 min后，見(jiàn)離心管底部灰白色細(xì)胞沉積，用3 ml吸管吸棄上清液，加入3 ml DMEM高糖培養(yǎng)液后反復(fù)吹打成單細(xì)胞混懸液；③將3 ml細(xì)胞混合懸液分別置于3個(gè)T25培養(yǎng)瓶中，再將每個(gè)T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液4 ml，放入37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)用10 μl移液槍抽取內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第2步中3 ml單細(xì)胞懸液用于技術(shù)，輕打入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，操作輕柔，勿產(chǎn)生氣泡，然后置于倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，取平均值。計(jì)數(shù)操作重復(fù)兩次。細(xì)胞數(shù)目：4象限細(xì)胞數(shù)總和/4×107/L。

1.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為6組，即A～F組，LBP濃度依次為0、20、50、100、200、500 μg/ml，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以減小誤差。

1.5細(xì)胞甩片技術(shù)應(yīng)用200 μg/ml LBP常規(guī)培養(yǎng)HUVECs 24 h，取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVECs，通過(guò)上述細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，利用D-PBS溶液配置HUVECs單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml，應(yīng)用100 μl移液槍抽取單細(xì)胞懸液100 μl，加入甩片槽中，調(diào)整甩片離心機(jī)，1 200 r/min，離心3 min，取出細(xì)胞載玻片，利用吉姆薩染液覆蓋細(xì)胞涂片，染色2 min，之后應(yīng)用清水沖洗掉粉紅色背景染色，放置于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)利用上述細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期血管內(nèi)皮細(xì)胞配制單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為每孔1.5×105個(gè)，接種于12孔板，待細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)成單細(xì)胞層時(shí)，用200 μl槍頭于板孔底面中軸劃一道劃痕，同時(shí)進(jìn)行劃痕部位拍攝，設(shè)空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組4個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h。以劃痕剩余面積測(cè)定LBP對(duì)HUVECs遷移能力影響。

1.7血管生成實(shí)驗(yàn)于實(shí)驗(yàn)前一天，將Matrigel基質(zhì)膠(BD公司)放于4℃融化。滅菌100 μl槍頭及96孔板冷藏備用。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，由冰箱中取出冷藏好的100 μl槍頭及96孔板，首先分組，設(shè)空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組4個(gè)復(fù)孔，目的為減少實(shí)驗(yàn)誤差，然后將Matrigel基質(zhì)膠加入96孔板(空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組)中，每孔50 μl，共8孔。在加入基質(zhì)膠時(shí)應(yīng)注意保持槍頭垂直于孔板中間位置，其中Matrigel基質(zhì)膠應(yīng)一直保持放在冰上，避免凝固。鋪膠完畢后，將含有Matrigel基質(zhì)膠的96孔板放入37℃孵育中孵育30 min，使基質(zhì)膠凝固。在此過(guò)程中，開(kāi)始準(zhǔn)備HUVECs懸液，通過(guò)利用上述細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法配置HUVECs單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml?？瞻讓?duì)照組為含10%胎牛血清DMEM高糖單細(xì)胞溶液，對(duì)照組為含LBP 200 μg/ml單細(xì)胞溶液，細(xì)胞密度相同，均為2×106/ml。從孵育箱中取出96孔板，可見(jiàn)基質(zhì)膠凝固完好，無(wú)氣泡產(chǎn)生，隨后將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液及空白對(duì)照組細(xì)胞懸液分別加入96孔板中，每孔100 μl，含HUVECs 20 000個(gè)。隨后將96孔板放入37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，每隔6 h記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終取24 h血管形成圖片。

1.8實(shí)驗(yàn)溶液配置①配置LBP母液。首先利用電子天平取35%含量LBP 10 mg，稱(chēng)量精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位，將稱(chēng)取的紅褐色LBP粉末輕倒入15 ml離心管中，隨后加入10 ml D-PBS稀釋?zhuān)筁BP粉末充分溶解，置于離心機(jī)中，500 r/min，后于超凈臺(tái)下應(yīng)用0.22 μm微孔濾菌膜濾過(guò)沉淀物質(zhì)及細(xì)菌，此時(shí)母液含量為1 μg/ml，母液配置完成。配置LBP實(shí)驗(yàn)溶液，以500 μg/ml濃度為例，首先應(yīng)用1 ml移液槍抽取母液1 ml置于2 ml Eppendorf管中，按1∶1加入10%胎牛血清DMEM高糖溶液1 ml，反復(fù)震蕩混勻，做好標(biāo)記后存放于4℃冰箱。20，50，100，200 μg/ml濃度依次按上述方法成比例配置。②配取MTT溶液。利用電子天平稱(chēng)取50 mg MTT，稱(chēng)量精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位，置于15 ml離心管中，加入D-PBS 10 ml,使其溶解，反復(fù)震蕩混勻，后于超凈臺(tái)內(nèi)應(yīng)用0.22 μm微孔濾膜除菌，分裝凍存于-20℃冰箱中貯存。③實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，利用上述細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，配置單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl(約含HUVECs 4 000個(gè))，四周邊孔應(yīng)用D-PBS隔離，每孔100 μl，從而減少細(xì)胞趨向運(yùn)動(dòng)。放37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)6～9 h，使細(xì)胞完全附壁同步，備用。

1.9MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度值觀察細(xì)胞貼壁良好后，將各實(shí)驗(yàn)組如前分組所示加入含不同濃度LBP培養(yǎng)基，空白對(duì)照組利用含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基代替。繼續(xù)放入孵育箱中培養(yǎng)24 h，然后每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μl，37 ℃孵育4 h，然后吸棄各孔中上清液，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩混勻，室溫放置10～15 min，使結(jié)晶充分溶解混勻，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定各組吸光度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組MTT檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。與A組(1.488±0.051)比較，C、D、E、F組對(duì)HUVECs生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，吸收值分別為1.334±0.048、1.040±0.068、0.765±0.051、0.479±0.052(P<0.01)，B組為1.490±0.015。依據(jù)半數(shù)致死量(LD50)，現(xiàn)選取200 μg/ml作為實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1　MTT 法測(cè)定各組吸光度值(×100)

2.2各組相對(duì)剩余面積比較實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相對(duì)剩余面積具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖2。實(shí)驗(yàn)濃度LBP可抑制新生血管形成，見(jiàn)圖3。

2.3細(xì)胞甩片技術(shù)大部分細(xì)胞萎縮、碎裂，部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體形成，見(jiàn)圖4。由此推斷LBP很可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，縮短細(xì)胞生存周期而達(dá)到抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用。

圖2　各組各時(shí)間點(diǎn)(×100)遷移面積

圖3　各組24 h血管形成情況

組別0h(μm2)24h(μm2)相對(duì)比(%)空白對(duì)照組42.26±1.4813.45±1.2868.22±2.07實(shí)驗(yàn)組43.19±1.0325.65±1.5640.63±2.811)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

圖4　HUVECs經(jīng)實(shí)驗(yàn)濃度LBP作用后細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化(×200)

3討論

中藥多糖對(duì)于臨床疾病的治療與預(yù)防有著新的領(lǐng)域及影響，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血脂、保肝等多種功能,其中中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)活性及抗腫瘤作用倍受關(guān)注〔1〕,抗腫瘤作用的活性成分已成為目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)〔2〕。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)100多種中藥中的多糖化合物具有免疫促進(jìn)作用〔3〕。LBP為其中之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等六種單糖組成〔4〕，具有提高機(jī)體免疫能力，抑制腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞活性及其數(shù)量的作用〔5〕。目前LBP能夠提高免疫力，增強(qiáng)免疫細(xì)胞殺傷能力已得到大量研究的證實(shí)，相關(guān)文獻(xiàn)表明，LBP可與樹(shù)突細(xì)胞(DC)表面存在的多糖受體結(jié)合〔6〕,活化的DC及其釋放的活性因子可間接作用T細(xì)胞，使其活性功能提高〔7〕，使T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闅蚑細(xì)胞，從而提高T細(xì)胞殺傷能力〔8〕；通過(guò)上調(diào)HL-60細(xì)胞表面MICA的表達(dá)，能增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷活性〔9〕，且與濃度呈正比；單獨(dú)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化和增殖不明顯。而與PHA協(xié)同作用后可使淋巴細(xì)胞明顯增殖〔10〕；同時(shí)LBP還可直接作用于腫瘤細(xì)胞，通過(guò)直接破壞癌細(xì)胞的膜表面結(jié)構(gòu)，使得腫瘤細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行正常的生命活動(dòng)，降低腫瘤細(xì)胞膜的流動(dòng)性〔11〕。

在腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境中不單純只有腫瘤細(xì)胞的存在，其中還有著大量的炎性細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞〔12〕，血管內(nèi)皮細(xì)胞為其中之一，其主要功能為參與腫瘤血管的生成，而新生血管的形成則與腫瘤生長(zhǎng)及遷移有著密不可分的聯(lián)系〔12〕。實(shí)體瘤的生長(zhǎng)具有血管依賴(lài)性，當(dāng)腫瘤間質(zhì)血管生成后，腫瘤細(xì)胞會(huì)呈指數(shù)倍增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)也隨之增加〔13〕。本實(shí)驗(yàn)表明，200 μg/ml LBP對(duì)HUVECs的增殖及遷移具有明顯的抑制作用，其機(jī)制很可能是縮短血管內(nèi)皮細(xì)胞周期，促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為新生血管最為關(guān)鍵的刺激因子〔14〕，推測(cè)LBP能夠降低其血清中含量〔15〕，從而達(dá)到對(duì)HUVECs形成新生血管明顯的抑制作用。200 μg/ml LBP作用于機(jī)體正?；|(zhì)細(xì)胞有無(wú)影響目前尚不明確，有待研究。

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〔2014-11-23修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)08-1819-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.013

通訊作者：白光(1959-)，男，主任醫(yī)師，主要從事普外科微創(chuàng)肝膽病研究。

基金項(xiàng)目：吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)臨床科研專(zhuān)項(xiàng)資助基金(No.320.6750.1281)；運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心及協(xié)同研究網(wǎng)絡(luò)建設(shè)項(xiàng)目(No.2013225305)

第一作者：尹遜天(1989-)，男，碩士在讀，主要從事肝膽疾病研究。