顏建輝　黃麗娟　楊　柳　陳雁斌　華力明

(湘南學(xué)院心腦血管研究所，湖南　郴州　423000)

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神經(jīng)鈣黏蛋白調(diào)控Akt/PKB信號通路對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

顏建輝1黃麗娟1楊柳1陳雁斌1華力明1

(湘南學(xué)院心腦血管研究所，湖南郴州423000)

〔摘要〕目的探討神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)調(diào)控蛋白激酶(Akt/PKB)信號通路對神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)生長的影響。方法利用RNAi技術(shù)將N-cadherin基因的RNA干擾載體pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒及pEGFP-MSCVneo對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)NSCs，分別作為干擾組和對照組，以原代培養(yǎng)NSCs作為正常組。Western印跡方法檢測各組細(xì)胞N-cadherin、蛋白激酶(PKB)、蛋白激酶磷酸化(P-PKB)、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)的蛋白表達(dá)水平。以MTT法檢測NSCs的增殖情況。結(jié)果與正常組和對照組相比，干擾組N-cadherin、PKB、P-PKB及PDK1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，其NSCs克隆形成率顯著減少(P<0.05)，NSCs增殖速度也顯著減慢(P<0.05)。結(jié)論沉默N-cadherin表達(dá)可能阻斷Akt/PKB信號通路，從而抑制NSCs的增殖。N-cadherin有望成為促進(jìn)NSCs增殖的潛在靶點(diǎn)。

〔關(guān)鍵詞〕神經(jīng)鈣黏蛋白；PKB信號通路；神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)具有自我更新、多向分化潛能的性質(zhì)，在脊髓損傷、腦創(chuàng)傷等神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性病變中都有潛在治療價(jià)值。正常情況下，NSCs大多處于休眠狀態(tài),當(dāng)受到缺血、外傷等傷害性刺激，能夠引起內(nèi)源性NSCs的增殖，但是其神經(jīng)再生能力存在局限性，不足以滿足自我修復(fù)的要求。因此采用合理的干預(yù)措施誘導(dǎo)、促進(jìn)NSCs增殖、再生，以修復(fù)損傷神經(jīng)及重建神經(jīng)功能，成為目前的研究熱點(diǎn)。神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)是黏附分子鈣黏蛋白超家族的重要成員，其主要生物學(xué)功能為介導(dǎo)間葉細(xì)胞間的黏附和遷移〔1〕。在神經(jīng)系統(tǒng)的繼續(xù)發(fā)育過程中，N-cadherin對神經(jīng)細(xì)胞的遷移、神經(jīng)突起的生長及突觸的形成發(fā)揮著重要的作用〔2〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，黑色素瘤細(xì)胞中N-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附可以激活A(yù)kt/蛋白激酶B(PKB)信號通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的存活〔3〕。由此推測，N-cadherin可能通過調(diào)控Akt/PKB通路影響NSCs的增殖。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物15 d清潔級SD孕鼠1只，由湘南學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要試劑巢蛋白(Nestin)、多聚賴氨酸(武漢博士德生物有限公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；N-cadherin鼠抗人單克隆抗體(Abcam公司)；PKB兔抗人抗體及蛋白激酶磷酸化(p-PKB) 兔抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司)；3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)鼠抗人單克隆抗體(Cell Signaling)；B27復(fù)合物、胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、G418培養(yǎng)基、PBS緩沖液(Thermo Scientific公司)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)(北京中杉金橋試劑有限公司)；熒光標(biāo)記FITC試劑、山羊抗鼠 IgG-FITC、DAB顯色劑、SABC免疫組化試劑盒(BIO-RAD公司)；病毒包裝細(xì)胞株293T(上海研晶生物科技有限公司)；pEGFP-MSCVneo 質(zhì)粒和pMSCVneo/N-cadherin 質(zhì)粒(上海研拓生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1RNAi沉默N-cadherin的表達(dá)病毒包裝細(xì)胞株293T接種至6 孔培養(yǎng)板中，待其匯合達(dá)90%～95%時(shí)，參照LipofectamineTM2000說明書用脂質(zhì)體法將pEGFP-MSCVneo質(zhì)粒和pMSCVneo /N-cadherin質(zhì)粒分別對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別收集病毒。

1.3.2NSCs的分離、培養(yǎng)取SD孕鼠，處死后取胎鼠分離腦組織，參照文獻(xiàn)〔4〕分離NSCs，置于DMEM/F12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每隔7 d左右傳代1次，收集培養(yǎng)1 w的第2代NSCs懸液，調(diào)整濃度至1×105/ml。

1.3.3病毒轉(zhuǎn)染NSCs將上述NSCs懸液等分為3份，分別為正常組、對照組及干擾組。將上述收集的pEGFP-MSCVneo病毒和pMSCVneo/N-cadheri病毒分別轉(zhuǎn)染至對照組和干擾組，然后置于G418培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；正常組不作任何處理，以DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1檢測NSCs克隆形成率7 d后，取上述各組單細(xì)胞懸液，分別按40個(gè)細(xì)胞/孔傳于6孔板，每組6個(gè)孔，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況并計(jì)數(shù)各孔內(nèi)的克隆球總數(shù)。計(jì)數(shù)克隆形成率:克隆形成率(%)=克隆球總數(shù)/接種活細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.2MTT法測定NSCs的生長曲線以無血清培養(yǎng)基將各組NSCs懸液接種于96孔培養(yǎng)板，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×104個(gè)，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，每孔加入MTT(5 g/L)溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集對數(shù)期細(xì)胞，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩10 min，并分別于4、12、20、28和36 h以酶標(biāo)儀自動測定540 nm波長時(shí)吸光值(A)，以反映細(xì)胞的生長狀況。

1.4.3BrdU免疫組化染色及陽性細(xì)胞比例取各組NSCs懸液10 μl，接種至預(yù)先包被0.01%多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，滴加BrdU抗體，濃度為1∶200，DAB顯色，脫水、透明，中性樹膠封片，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照。每張蓋片鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，陽性細(xì)胞比例(%)=陽性細(xì)胞總數(shù)/接種活細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.4Western印跡檢測N-cadherin、PKB、p-PKB及PDK1的蛋白表達(dá)各組NSCs懸液加入裂解液，離心、取上清，獲取總蛋白量。凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，參照試劑盒說明書，分別加入一抗N-cadherin、PKB、p-PKB及PDK1，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，以β-actin作為對照，ECL發(fā)光顯色，以圖像分析系統(tǒng)對圖中印跡區(qū)帶進(jìn)行定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組NSCs生長情況及克隆球計(jì)數(shù)正常組NSCs生長良好，呈單個(gè)圓球形，培養(yǎng)液中可見數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞克隆球，細(xì)胞排列規(guī)則緊密，有放射狀微小突出伸出。對照組NSCs生長情況與正常組相比無顯著差異。干擾組NSCs克隆球計(jì)數(shù)〔(3.2±0.4)%〕，顯著低于正常組和對照組〔(22.8±0.1)%，(21.3±0.2)%〕(P<0.05)。見圖1。

2.2各組NSCs的生長曲線正常組和對照組的A值無顯著差異，而干擾組的A值則顯著低于正常組及對照組(P<0.05)。見表1。2.3各組BrdU免疫組化染色及陽性細(xì)胞比例BrdU陽性細(xì)胞呈棕褐色，形態(tài)多樣，呈圓形、橢圓形或梭性。干擾組BrdU陽性細(xì)胞比例〔(35.3±1.1)%〕，顯著低于正常組及對照組〔(76.2±1.9)%、(73.4±0.7)%〕(P<0.05)。見圖2。

2.4各組N-cadherin、PKB及PDK1的蛋白表達(dá)正常組和對照組N-cadherin、PKB、p-PKB及PDK1的蛋白表達(dá)無差異，而經(jīng)過siRNA干擾后，干擾組各項(xiàng)蛋白表達(dá)均顯著減弱(P<0.05)。見圖3，表2。

圖1　各組NSCs克隆球的細(xì)胞形態(tài)(×100)

時(shí)間4h12h20h28h36h正常組0.1161)0.1391)0.1501)0.1691)0.1751)對照組0.1231)0.1401)0.1561)0.1701)0.1821)干擾組0.0790.0640.0470.0390.021

與干擾組比較：1)P<0.05

正常組

對照組

干擾組

圖3　各組N-cadherin、PKB、p-PKB及PDK1的蛋白表達(dá)

組別N-cadherinPKBp-PKBPDK1正常組86.41±9.15127.14±12.1978.75±10.3684.18±6.57對照組85.28±8.67126.37±11.8677.82±11.0183.46±6.38干擾組67.16±7.03108.25±13.0561.54±8.7363.09±5.54

3討論

N-cadherin主要有介導(dǎo)間葉細(xì)胞間的動態(tài)黏附作用,在神經(jīng)軸突的導(dǎo)向生長、靶向識別以及突觸形成中發(fā)揮著重要作用〔5〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)功能多樣化，如介導(dǎo)信號傳導(dǎo)、基因激活、細(xì)胞凋亡、增殖和遷移等〔6〕。

Akt又稱PKB，即蛋白激酶B，在神經(jīng)干細(xì)胞分化、神經(jīng)信號的傳導(dǎo)中起重要作用〔7〕，Akt信號蛋白增多能夠降低神經(jīng)細(xì)胞損傷后的自我吞噬能力，同時(shí)還具有抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)損傷區(qū)血管再生作用〔8〕。研究表明，PDK1是PKB的上游激酶，PDK1和Akt蛋白之間存在一定的關(guān)系，PDK1通過與3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇作用可以激活相鄰的PKB分子〔9〕；同時(shí)，Akt和磷脂相互作用，導(dǎo)致其向膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，使其磷酸化及被PDK1和PDK2活化，激活的Akt在多種基質(zhì)作用下調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞生長〔10〕，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Akt/mTOR/p70S6K 通路信號能增加大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)新神經(jīng)元的形成〔11〕。

本實(shí)驗(yàn)將提示沉默N-cadherin表達(dá)可能會抑制NSCs的增殖。正常組和對照組N-cadherin、pKB、P-pKB及PDK1蛋白表達(dá)無顯著差異，經(jīng)過siRNA干擾后，干擾組N-cadherin、PKB、p-PKB及PDK1蛋白表達(dá)均顯著減弱。因此推測沉默N-cadherin表達(dá)，可能會下調(diào)PDK1的表達(dá)，作為Akt/PKB信號通路的上游靶基因，其表達(dá)減弱導(dǎo)致該信號通路被阻斷，Akt活性被抑制，從而抑制了NSCs的增殖。

4參考文獻(xiàn)

1Maret D，Gruzglin E，Sadrm S，etal.Surface expression of precursor N-cadherin promotes tumor cell invasion〔J〕.Neoplasia,2010；12(2):1066-80.

2Latefi NS，Pedraza L，Schohl A，etal.N-cadherin prodomain cleavage regulates synapse formation in vivo〔J〕.Dev Neurobiol,2009；69(2):518-29.

3Li G，Satyamoorthy K，Herlyn M.N-cadherin-mediated intercellular interactions promote survival and migration of melanoma cells〔J〕.Cancer Res,2001；61(9):3819-25.

4Tong L，Ji LL，Wang ZY，etal.Differentiation of neural stem cells into Schwann-like cells in vitro〔J〕.Biochem Biophy Res Comm,2010；401(4):592-7.

5Latefi NS，Pedraza L，Schohl A，etal.N-cadherin prodomain cleavage regulates synapse formation in vivo〔J〕.Dev Neurobiol,2009；69(8):518-529.

6Ando K，Uemura K，Kuzuya A，etal.N-cadherin regulates p38 MAPK signaling via association with JNK-associated leucine zipper protein：implications for neurodegeneration in Alzheimer disease〔J〕.Biol Chem,2011；286(9):7619-28.

7Zhuang Z，Zhao X，Wu Y，etal.The anti-apoptotic effect of PI3K-Akt signaling pathway after subarachnoid hemorrhage in rats〔J〕.Ann Clin Lab Sci,2011；41(4):364-72.

8張珊珊,羅勇,武磊.PI3K/AKT通路在電針促進(jìn)局灶腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)血管再生中的作用〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010；32(23):2488-91.

9Ding ZY，Liang JY，Li J，etal.Physical association of PDK1 with AKT1 is sufficient for pathway activation independent of membrane localization and phosphatidylinositol 3 kinase〔J〕.PLoS One,2010；5(3):9910-20.

10Michael AG，Quintin P.Protein kinase Cε：an oncogene and emerging tumor biomarker〔J〕.Mol Cancer,2009；8(9):1-8.

11Hu LY，Sun ZG，Wen YM，etal.ATP-mediated protein kinase B Akt/mammalian target of rapamycin mTOR/p70 ribosomal S6 protein p70S6 kinase signaling pathway activation promotes improvement of locomotor function after spinal cord injury in rats〔J〕.Neuroscience，2010；169(3):1046-62.

〔2014-03-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R39

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1807-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.007

1湘南學(xué)院附屬醫(yī)院

第一作者：顏建輝(1974-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管病變研究。