孫帥軍　王新宇　黃小玲　陳葉香　王　曼　蔣寶平　許　立

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　南京　210023)

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·基礎(chǔ)研究·

丹酚酸B對(duì)大鼠缺血心肌組織溶酶體功能的影響

孫帥軍王新宇黃小玲陳葉香王曼蔣寶平1許立1

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023)

〔摘要〕目的探討丹酚酸B(Sal B)對(duì)異丙腎上腺素(ISO)所致大鼠心肌缺血模型心肌溶酶體功能的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，丹參注射液組和Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg組。除空白組外，各組大鼠尾靜脈注射ISO建立急性心肌缺血模型，連續(xù)給藥7 d后，PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠心電圖變化;試劑盒測(cè)定血清中溶酶體相關(guān)膜蛋白2(Lamp-2)、組織蛋白酶D(Cat-D)的活性，心臟勻漿中一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、Cat-D和溶酶體勻漿中Cat-D的活性;HE染色法檢測(cè)心肌梗死面積。結(jié)果與空白對(duì)照組比較(P<0.05或P<0.01)，模型組大鼠心電圖T波水平顯著升高，血清中Lamp-2、Cat-D的水平顯著升高，心臟勻漿中NOS、NO、Cat-D含量升高，溶酶體勻漿中Cat-D含量降低，心肌梗死面積明顯增多。Sal B 12.8、6.4 mg/kg組和丹參注射液組能夠顯著降低心電圖T波升高值，降低血清lamp2、Cat-D和心臟勻漿中NOS、NO、Cat-D含量,升高心臟溶酶體勻漿Cat-D含量，與模型組比較(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論Sal B對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用與溶酶體的膜穩(wěn)定性及水解酶的活性功能有一定的關(guān)系。

〔關(guān)鍵詞〕丹酚酸B；心肌缺血；溶酶體；組織蛋白酶D

心肌缺血主要由血壓降低、主動(dòng)脈供血減少、冠狀動(dòng)脈阻塞等導(dǎo)致〔1〕。丹參注射液具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，主要用于治療冠心病心絞痛、心肌梗死等疾病〔2〕。丹酚酸B(Sal B)是丹參的水溶性有效成分，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病有保護(hù)作用，主要機(jī)制為抗氧化和清除自由基等〔3〕。心肌受損時(shí)，溶酶體在胞內(nèi)發(fā)揮維持新陳代謝及細(xì)胞功能活性等作用。本實(shí)驗(yàn)主要探討心肌受損時(shí)Sal B對(duì)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用及與溶酶體功能的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1藥品與試劑Sal B(南京先慧醫(yī)藥工程研究有限公司，批號(hào)13091310)，異丙腎上腺素(ISO,sigma公司,批號(hào)Lot#SLBG3431V)，丹參注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司,批號(hào)1309233)，氯化鈉注射液(江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司,批號(hào)13052402)，溶酶體相關(guān)膜蛋白2(Lamp-2)試劑盒、組織蛋白酶D(CatD)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)201505)。

1.2儀器Power-Lab 6.0數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞AD Instrument),FA1204B型分析天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)，Synergy HT型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，CKX31型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，Allegra 64R型冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman-Coulter公司)。

1.3動(dòng)物健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級(jí)，60只，雌雄各半，體重180～220 g，采購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SXCK(蘇)：2014-0105〕。飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫18℃～22℃，濕度50%～60%。

1.4實(shí)驗(yàn)方法將大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，丹參注射液組，Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg組，每組10只。Sal B各組大鼠分別每日尾靜脈注射Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg，連續(xù)7 d；丹參注射液組大鼠每日尾靜脈注射丹參注射液4 000 mg/kg連續(xù)7 d，模型組和空白組每日給予等量生理鹽水。各組以2 ml/kg體積尾靜脈注射藥物。末次給藥后除空白組外，尾靜脈注射ISO 5 mg/kg，2次/d，連續(xù)2 d。ISO造模后第3天，大鼠禁食不禁水12 h，描記描記大鼠1、3、5、10、15、20、30 min心電圖(ECG)，記錄S-T段的變化，若具備以下條件之一者判斷為造模成功：①ST段水平向下或向上偏移≥0.1 mV；②T波高聳超過(guò)同導(dǎo)聯(lián)R波的1/2；③T波高聳伴ST段移位。心電圖記錄完畢后，頸動(dòng)脈插管取血，于高速冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，離心后取血清，-20℃凍存，備用。摘取心臟，石蠟包埋，切成4 μm石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.5心肌酶學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)取心臟，以冰生理鹽水洗去殘留血液，濾紙吸干后切下約2 mm的心尖部分，制成10%的生理鹽水心肌組織勻漿，部分以3 000 r/min離心10 min，取上清-20℃凍存，備用。取部分心肌組織勻漿高速離心，2 500 r/min離心10 min分離出結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞核、細(xì)胞碎片，7 200 r/min離心10 min分離出線粒體；13 000 r/min離心10 min分離出溶酶體，制備分離出溶酶體勻漿。取上清-20℃凍存，備用。按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定心臟勻漿中NOS、NO、Cat-D和溶酶體勻漿中Cat-D的活性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1一般情況觀察空白組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食規(guī)律且正常，活動(dòng)狀況良好。模型組大鼠飲食較少，精神狀態(tài)差。各用藥組大鼠較模型組精神狀態(tài)相對(duì)有所改善，食量基本正常，活動(dòng)情況較模型組也有改善。

2.2ECG的檢測(cè)空白組、丹參注射液組與模型組比較，1～30 min時(shí)間段內(nèi)，各個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。Sal B 12.8、6.4 mg/kg組與模型組比較，在3～20 min時(shí)間段，T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。Sal B 3.2 mg/kg組與模型組比較，在10、20 min處，T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。在其余各時(shí)間段Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg組與模型組比較雖有降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sal B 12.8 mg/kg組與丹參注射液組作用相近。見(jiàn)表1。

表1Sal B對(duì)急性心肌缺血大鼠ECG T波抬高值的影響(x±s，n=10,mV)

組別劑量(mg/kg)即刻1min3min5min10min15min20min30min空白組-0.05±0.010.05±0.011)0.05±0.010.06±0.021)0.05±0.012)0.05±0.011)0.06±0.011)0.05±0.011)模型組-0.05±0.020.06±0.030.09±0.060.08±0.020.08±0.020.09±0.050.11±0.050.14±0.04丹參注射液組40000.04±0.010.05±0.021)0.05±0.011)0.05±0.012)0.05±0.012)0.05±0.011)0.05±0.021)0.06±0.012)SalB組12.80.05±0.010.05±0.010.04±0.011)0.05±0.012)0.05±0.012)0.05±0.020.06±0.031)0.06±0.012)SalB組6.40.05±0.020.05±0.020.05±0.021)0.05±0.022)0.05±0.012)0.05±0.011)0.05±0.022)0.10±0.02SalB組3.20.05±0.020.06±0.020.07±0.030.08±0.050.06±0.021)0.06±0.020.05±0.021)0.10±0.04

與模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01，下表同

2.3血清酶學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)空白組、丹參注射液組、Sal B 12.8、6.4 mg/kg組與模型組比較，血清中Lamp-2、Cat-D濃度顯著下降(P<0.05或P<0.01)；Sal B 3.2 mg/kg組與模型組比較無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表2。

2.4心肌酶學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)空白組、丹參注射液組、Sal B 12.8、6.4 mg/kg組與模型組比較，組織勻漿中NO、NOS濃度顯著升高，Cat-D濃度顯著下降，心臟溶酶體勻漿中Cat-D濃度顯著升高(P<0.05或P<0.01)；Sal B 3.2 mg/kg組與模型組比較無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表2，表3。

表2Sal B對(duì)血清中Lamp-2、Cat-D含量的影響(x±s，n=10)

組別劑量(mg/kg)血清Lamp-2(pg/ml)Cat-D(ng/ml)心臟溶酶體勻漿Cat-D(ng/ml)空白組-0.13±0.022)3.45±2.352)35.93±3.752)模型組-0.17±0.0417.09±3.7929.29±6.24丹參注射液組40000.13±0.022)12.44±4.051)36.40±5.281)SalB組12.80.14±0.022)14.00±2.301)37.88±4.512)SalB組6.40.14±0.021)15.67±3.1531.78±4.59SalB組3.20.14±0.0216.06±3.3430.25±4.86

表3Sal B對(duì)心臟勻漿中NO、NOS、Cat-D含量的影響(x±s，n=10)

組別劑量(mg/kg)NOS(μmol/L)NO(μmol/L)Cat-D(ng/ml)空白組-28.47±1.252)28.56±4.312)3.45±2.352)模型組-19.96±1.1818.05±3.6817.09±3.79丹參注射液組400026.60±2.412)25.84±2.562)12.44±4.051)SalB組12.825.91±1.432)24.521±3.481)14.00±2.301)SalB組6.423.87±2.612)22.63±2.171)15.67±3.15SalB組3.222.09±1.551)20.26±3.9016.06±3.34

2.5Sal B對(duì)急性心肌缺血大鼠病理組織學(xué)的影響空白組大鼠心臟心肌細(xì)胞橫紋清晰，未見(jiàn)增生肥大、萎縮、斷裂，無(wú)細(xì)胞變性、壞死等病變，間質(zhì)無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心外膜、心內(nèi)膜無(wú)異常；模型組8例心臟可見(jiàn)局灶性大量心肌纖維重度變性壞死、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，余2例心臟可見(jiàn)局灶性心肌纖維變性壞死、中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)；丹參注射液組9例可見(jiàn)局灶性心肌纖維輕度變性壞死、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，1例局灶性心肌纖維變性壞死、中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)；Sal B 12.8 mg/kg組8例心臟可見(jiàn)局灶性心肌纖維輕度變性壞死、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，2例局灶性心肌纖維變性壞死、中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)；6.4 mg/kg組3例心臟可見(jiàn)大量心肌纖維重度變性壞死、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，7例局灶性心肌纖維變性壞死、輕中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)；3.2 mg/kg組5例心臟可見(jiàn)大量心肌纖維重度變性壞死、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，5例局灶性心肌纖維變性壞死、輕中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

空白組、丹參注射液組、Sal B 12.8 mg/kg組與模型組比較，心肌纖維變性壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表4。

圖1　Sal B對(duì)急性心肌缺血大鼠病理組織學(xué)影響

表4Sal B對(duì)急性心肌缺血大鼠病理評(píng)分的影響(n，n=10)

組別劑量(mg/kg)心肌纖維變性壞死ⅠⅡⅢⅣ炎細(xì)胞浸潤(rùn)ⅠⅡⅢⅣ空白組2)-1000010000模型組000820082丹參注射液組2)400009100910SalB組2)12.808200820SalB組6.403430343SalB組3.202350235

3討論

ECG中T波的上升程度以及ST波段的改變可以反映心肌缺血和心肌損傷的嚴(yán)重程度。Sal B可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加側(cè)支循環(huán)、降低冠脈阻力，使其在心排出量不增加的前提下增加冠脈血流量、提高心肌血流量，改善缺血區(qū)的供血供氧，維持心臟作用〔4〕。本實(shí)驗(yàn)在注射ISO后，可明顯發(fā)現(xiàn)T波上移、ST波段顯著性下降；病理組織染色發(fā)現(xiàn)，ISO注射后心肌纖維重度變性壞死，明顯空泡變性及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而在給予Sal B 12.8、6.4 mg/kg后心電圖T波變化、病理?yè)p傷有顯著改善。

ISO誘導(dǎo)心肌受損，產(chǎn)生的氧自由基等引起血管內(nèi)皮受損，從而抑制NOS活性。NO由NOS催化完成，通過(guò)抑制超氧陰離子和脂質(zhì)過(guò)氧自由基所引起的過(guò)氧化損傷，對(duì)缺血后心功能的恢復(fù)及預(yù)后具有重要作用〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)Sal B能夠提高內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)，適度地活化iNOS，促進(jìn)NO的合成〔6〕。本實(shí)驗(yàn)表明Sal B的心肌保護(hù)作用與氧自由基清除有關(guān)。

心肌受損產(chǎn)生過(guò)量的活性氧及自由基可誘發(fā)溶酶體膜通透性增加，影響溶酶體功能進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。溶酶體內(nèi)含組織蛋白酶在內(nèi)的多種高濃度酸性水解酶，這些水解酶可將與溶酶體融合的吞噬小泡所含的物質(zhì)降解成小分子，從而維護(hù)機(jī)體的正常生理代謝〔7〕。心肌受損時(shí)，溶酶體在凋亡信號(hào)的作用下，激活溶酶體內(nèi)Cat-D、Cat-B等水解酶的活性，通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)炎癥因子等，從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的功能〔8〕。Conus等〔9〕研究表明，細(xì)胞受損時(shí)，溶酶體釋放了大量Cat-D、Cat-G等Cat，Cat-D通過(guò)激活caspase-8誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。在心肌受損時(shí)，Cat-D等水解酶從細(xì)胞內(nèi)的溶酶體內(nèi)大量釋放入胞外，因此，病理?xiàng)l件下Cat-D在組織和血清高表達(dá)。Lamps覆蓋在溶酶體膜表面，是穩(wěn)定溶酶體膜蛋白及膜結(jié)構(gòu)完整性的重要蛋白〔10〕。番茄紅素等能夠?qū)SO所致的心肌受損大鼠發(fā)揮保護(hù)作用，認(rèn)為其主要通過(guò)穩(wěn)定溶酶體膜。保護(hù)溶酶體功能，進(jìn)而發(fā)揮清除自由基、抗氧化等抗炎作用，保護(hù)心肌細(xì)胞〔11〕。Kreuzaler等〔12〕應(yīng)用siRNA技術(shù)去除Lamp-2后溶酶體膜的通透性增加，導(dǎo)致溶酶體的完整性破壞和細(xì)胞的死亡?？傊緦?shí)驗(yàn)表明，Sal B對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用與溶酶體的膜穩(wěn)定性及水解酶的活性有關(guān)。

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〔2015-12-25修回〕

(編輯袁左鳴)

Protective effects of salvianolic acid B on lysosomal dysfunction in isoproterenol induced myocardial ischemic rats

SUN Shuai-Jun，WANG Xin-Yu，HUANG Xiao-Ling，et al.

Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,Jiangsu,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the protective effects of salvianolic acid(Sal) B on lysosomal dysfunction in isoproterenol induced myocardial ischemic rats.MethodsAll rats were randomly divided into control,model,Salvia miltiorrhiza injection and Sal B 12.8,6.4,3.2 mg/kg groups.The effects of Sal B on the electrocardiogram(ECG) at different time points were observed.The serum levels of lysosomal-associated membrane protein(lamp)-2 and cathepsin(cat)-D were measured.Also the levels of cat-D,nitric oxide(NO),nitric oxide synthase(NOS) in homogenate of myocardial tissue and cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue were tested.Meanwhile,the myocardial tissue pathological changes were observed.ResultsThe levels of Lamp-2 and Cat-D in serum,NOS,NO and Cat-D in homogenate of myocardial tissue of model group were increased;and the level of Cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue was reduced(P<0.05 or P<0.01) compared with those of control group.The contents of Lamp-2 and Cat-D in serum,NOS,NO and Cat-D in homogenate of myocardial tissue were decreased in Sal B 12.8,6.4 mg/kg and Salvia miltiorrhiza injection groups;and the level of Cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue was increased compared with that of model group(P<0.05 or P<0.01).ConclusionsSal B has protective effects on myocardial ischemic rats,its mechanism might be related with the function of hydrolytic enzymes and lysosomal membrane stability.

【Key words】Salvianolic acid B;Myocardial ischemia;Lysosome;Cathepsin D

〔中圖分類號(hào)〕R28

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)08-1789-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.001

通訊作者：許立(1964-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家十二五重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)(No.2011ZX09102-002-07)

1江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：孫帥軍(1989-)，男，碩士，主要從事中藥藥理研究。