●謝宏贊 張旭橋 仇湘中 蔣盛昶 張信成

活血健腰湯對大鼠退變椎間盤TNF-a表達的影響

●謝宏贊 張旭橋 仇湘中 蔣盛昶 張信成

目的：觀察活血健腰湯對腰椎間盤退變大鼠髓核組織腫瘤壞死因子-a(TNF-a)表達的干預(yù)作用，探討活血健腰湯防治腰椎間盤退變的療效機制。方法:40只10月齡SD大鼠隨機分為造模組30只、假手術(shù)組10只；采用纖維環(huán)穿刺法建立椎間盤退變模型，造模組造模成功后隨機分為模型組、活血健腰湯組、布洛芬組，每組各8只、造模成功給藥20天后檢測大鼠髓核組織TNF-a的表達水平。結(jié)果:模型組腰椎間盤髓核組織TNF-a表達較假手術(shù)組增高，差異均有非常顯著性意義(P＜0.01)；活血健腰湯組腰椎間盤髓核組織TNF-a的含量均低于模型組，差異均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；布洛芬組腰椎間盤髓核組織IL-1的含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:活血健腰湯可能是通過抑制大鼠退變腰椎間盤髓核組織中致炎因子TNF-a的表達來減輕腰椎間盤的退行性改變。

腰椎間盤退變；活血健腰湯；腫瘤壞死因子-a；大鼠

椎間盤退變是盤源性腰痛的病理機制，也是腰椎間盤突出癥的病變基礎(chǔ)，是臨床非常常見的疾病。課題組先后采用自擬方活血健腰湯治療腰椎間盤突出癥微創(chuàng)術(shù)后殘余癥狀均獲得滿意療效[1-2]，為進一步探索其治療機理，課題組特開展活血健腰湯對大鼠退變椎間盤NF-a表達的影響的研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

①動物健康SD大鼠40只，雌雄兼用，體質(zhì)量250～300g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2015-0027。

②藥物活血健腰湯處方來源于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院骨傷科，藥物組成：當(dāng)歸15g、川芎12g、赤芍15g、熟地25g、活血藤15g、元胡10g、續(xù)斷12g、蜈蚣1條、全蝎3g、甘草5g，藥物均購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，常規(guī)煎煮，冰箱內(nèi)冷藏48h，將冷藏液離心，上清液濾過，得混懸藥液濃度為含生藥21.6g/10mL，5℃保存?zhèn)溆?。陽性對照藥物布洛芬，由中美史克公司生產(chǎn)，規(guī)格為每粒0.3g，配制成含生藥10.7mg/10mL 混懸液，批號：20150702，國藥準字H10900089。

③主要試劑青霉素鈉注射劑：80萬U/支，華北制藥股份有限公司，批號：F2503426。0.9%氯化鈉注射液：國藥集團容生制藥有限公司，批號：1207301-031。滅菌注射用水：國藥集團容生制藥有限公司，批號：1204514-B11。

④主要儀器HM335E型切片機，德國MICROM公司；AP280-123型包埋機，德國MICROM公司；Eclipse.E2OO型光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司；透射電子顯微鏡JEM-1230型，日本電子公司；微型高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器設(shè)備廠；MultiskanMK3 型酶標檢測儀，芬蘭雷勃公司；解剖顯微鏡：K-400L麥克奧迪實業(yè)集團中國有限公司。

1.2 方法

①動物分組動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，40只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為造模組30只、假手術(shù)組10只。

②造模方法采用纖維環(huán)針刺法[3]復(fù)制動物模型。10%水合氯醛(3mL/ kg）腹膜內(nèi)麻醉，剪毛、左側(cè)臥位固定大鼠、消毒、鋪無菌巾。取右腹后外側(cè)正中切口長約2cm，腹外斜肌與背肌之間剪開，腹膜外入路到達椎體右側(cè)方，依據(jù)髂嵴定位(平L6椎體)，暴露L3-4、L4-5、L5-6 椎間隙，用16G穿刺針頭，由椎間盤纖維環(huán)前外側(cè)方平行終板，與脊柱矢狀面呈約450角方向刺入L4-5，深度控制在2.3mm,行全層針刺，維持10s后拔針,術(shù)畢逐層縫合創(chuàng)口。假手術(shù)對照組：僅切開皮膚后縫合。并連續(xù)3d各組大鼠均腹腔注射青霉素鈉鹽20 萬U/kg，每天1 次，以預(yù)防切口感染。術(shù)后各組大鼠在23～25℃環(huán)境中，同等正常條件下單籠標準飼料喂養(yǎng)20天。

③給藥方法造模成功單籠常規(guī)飼養(yǎng)20天后，開始灌胃給藥，中西藥服藥劑量按成人體質(zhì)量70kg等劑量計算大鼠用藥劑量?；钛⊙鼫M：灌胃體積10mL/kg， 給藥劑量為3.9 g/（kg·d），連續(xù)20天；布洛芬組：灌胃體積10 mL/kg，給藥劑量為0.1 g/（kg·d），連續(xù)20天；模型組及假手術(shù)組則每日灌予同等量飲用水，連續(xù)20天。兩種藥物的總量均分早、晚兩次灌服。

④標本收集給藥20天，末次給藥后12h，所有大鼠均采用腹腔注射過量10%水合氯醛麻醉處死大鼠，沿上、下軟骨終板與椎體的交界面完整切取大鼠L4-5椎間盤，置于-80℃冰箱保存待測。

⑤檢測指標及方法造模手術(shù)20天后，治療組、造模組、假手術(shù)和對照組各隨機抽取2只大鼠進行電鏡下椎間盤的超微結(jié)構(gòu)觀察；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)進行TNF-α含量的測定，標本送長沙維爾生物科技有限公司檢測。

⑥統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料采用“±s”表示，方差齊采用單因素方差分析，若方差不齊采用Tamhane＇s T2，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模過程中大鼠死亡情況造模期間死亡大鼠3只，其中假手術(shù)組1只，模型組2只。再采用隨機數(shù)字表法將造模組造模成功大鼠24只分為模型組、活血健腰湯組、布洛芬組，每組各8只。

2.2 各組大鼠腰椎間盤髓核組織中TNF-α含量比較

活血健腰湯組、布洛芬組、模型組腰椎間盤髓核組織TNF-α的含量均高于假手術(shù)組，差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；活血健腰湯組腰椎間盤髓核組織TNF-α的含量均低于模型組，差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。活血健腰湯腰椎間盤髓核組織TNF-α的含量與布洛芬組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1

表 1 實驗 6 周后大鼠腰椎間盤髓核組織中TNF-α含量比較 （±s，ng/L）

表 1 實驗 6 周后大鼠腰椎間盤髓核組織中TNF-α含量比較 （±s，ng/L）

注：與假手術(shù)組組比較 ＃P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01。

組別數(shù)量TNF-α假手術(shù)組53.18±1.62模型組812.09±2.36#活血健腰湯組89.22±2.39#△布洛芬組810.79±2.54#

圖1 假手術(shù)組喂藥20天時鏡下表現(xiàn)

圖2 模型組喂藥20天時鏡下表現(xiàn)

圖3 對照組20天時鏡下表現(xiàn)

圖4 活血健腰湯組20天時鏡下表現(xiàn)

3 討論

中醫(yī)藥治療盤源性腰痛歷史悠久、療效確切，仇湘中教授根據(jù)其30多年臨床經(jīng)驗提出：盤源性腰痛需從“肝虛血瘀”論治[4]，本研究采用的活血健腰湯取法于明朝醫(yī)家張三錫所著《醫(yī)學(xué)六要·治法匯》卷七之“補肝湯”（熟地、當(dāng)歸、川芎、芍藥、木瓜、酸棗仁、甘草）：去“補肝湯”中酸棗仁、木瓜、改生地為熟地，并加活血藤、續(xù)斷、蜈蚣、全蝎、元胡組成。“四物湯”為活血化瘀、補血柔肝的代表方，也是歷代醫(yī)家治療血瘀的最常用的方劑之一，改白芍為赤芍后活血化瘀的功效更強；“補肝湯”功效為養(yǎng)血柔肝，活血調(diào)經(jīng)。張三錫在《醫(yī)學(xué)六要·治法匯》中對“補肝湯”主治功效記載如下：“主肝血不足，頭目眩暈，少寐，月經(jīng)量少，以及血不養(yǎng)筋，肢體麻木，小腿轉(zhuǎn)筋”，其中“血不養(yǎng)筋，肢體麻木，小腿轉(zhuǎn)筋”與腰椎間盤病變的癥狀體征極其相似，因此，課題組運用活血健腰湯治療盤源性腰痛具有充足的理論依據(jù)。

“活血健腰湯”中當(dāng)歸活血化瘀、補肝柔肝為君藥；熟地、芍藥、活血藤、元胡、續(xù)斷、甘草則補血柔肝、化瘀通絡(luò)、緩急止痛，共為臣藥；佐藥川芎、蜈蚣、全蝎有加強活血通絡(luò)止痛、助藥力直達病所之功；甘草之調(diào)和諸藥的功效則為使。全方共奏活血化瘀、柔肝緩急，通絡(luò)止痛的作用，故用于臨床治療瘀血型腰椎間盤突出癥取得了滿意的療效。肝為藏血之臟，血的代謝異常則導(dǎo)致肝失所養(yǎng)，故筋不得柔，發(fā)為腰腿攣急疼痛。方中熟地甘溫味厚，而質(zhì)柔潤，長于滋陰養(yǎng)血。當(dāng)歸補血養(yǎng)肝，和血調(diào)經(jīng)。赤芍活血養(yǎng)血、柔肝和營，川芎活血行氣，調(diào)暢氣血，活血藤功?；钛?。其中地、芍為陰柔之品，與辛溫之歸、芎相配，則補血而不滯血，和血而不傷血，四藥有活血藤之助，活血化瘀之力更強，而在甘草、元胡、熟地的緩解反制之下，活血而不傷正。續(xù)斷甘溫補益，為平補肝腎之要藥，又有活血通絡(luò)之功效。蜈蚣辛溫走竄，通經(jīng)逐邪，有調(diào)達肝經(jīng)通絡(luò)止痛之功,為鎮(zhèn)痛、散結(jié)之要藥。全蝎味辛,能行風(fēng)藥直達病所,與蜈蚣配伍則通絡(luò)止痛之效倍增。延胡索活血、理氣、止痛。甘草緩急柔肝、補血調(diào)中、調(diào)和諸藥，即可防止活血化瘀制品傷脾胃、又可緩急柔肝止肢體麻木，小腿轉(zhuǎn)筋之癥，還可調(diào)和諸藥行使使藥之功。綜觀全方，結(jié)構(gòu)緊密、渾然一體，具有養(yǎng)血柔肝、活血化瘀、通絡(luò)止痛之效，從而使腰部疼痛及患肢麻木疼痛諸癥得以緩解。全方結(jié)構(gòu)緊密、渾然一體，具有養(yǎng)血柔肝、活血化瘀、通絡(luò)止痛之效，故用于臨床治療瘀血型腰椎間盤突出癥取得了滿意的療效?，F(xiàn)代藥理研究證實，上方有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)的作用?？山档兔氀芡ㄍ感?，改善微循環(huán)，消除神經(jīng)水腫及肌肉痙攣，增強人體抵抗力，緩解對神經(jīng)根的化學(xué)及自然免疫刺激等作用[4]。

椎間盤退變是一個動態(tài)的復(fù)雜過程，引起退變的確切原因尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)椎間盤中的細胞因子在椎間盤退行性變的病理過程中發(fā)揮重要的作用，目前已知的細胞因子有100 多種，其中，IL-1、IL-6、TNF-α、NO 等被公認為是參與椎間盤退變的最重要的細胞因子[5]。研究顯示：TNF-α與椎間盤退變關(guān)系密切[6]，有足夠的證據(jù)表明它們均參與椎間盤退變的過程[7]。大量研究表明：TNF-α可促使血管生成誘導(dǎo)因子如血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、MMP-7 及血漿酶的產(chǎn)生，從而使蛋白多糖減少，椎間盤組織被吸收[8]。本研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，活血健腰湯能抑制腰椎間盤髓核組織中TNF-α的表達，說明活血健腰湯對于機體內(nèi)細胞因子有調(diào)節(jié)作用，可抑制炎性物質(zhì)的釋放，也初步提示，活血健腰湯極有可能是通過抑制TNF-α的合成和分泌發(fā)揮其延緩椎間盤退變的作用。

（作者單位:謝宏贊 張旭橋:湘潭市中醫(yī)醫(yī)院；仇湘中 蔣盛昶 張信成：湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院）

[1]張旭橋,姜升平,王曉暉,等.活血健腰湯對腰椎間盤突出癥射頻消融術(shù)后臨床療效的影響[J].中醫(yī)臨床研究,2014,6(2):17-20.

[2]張旭橋,姜升平,王曉暉,等. 活血健腰湯治療腰椎間盤突出癥微創(chuàng)術(shù)后殘余癥狀1例[J]. 中國中醫(yī)骨傷科雜志,2014,22(6):61-62.

[3]黃河,李寧寧,胡朝暉,等.纖維環(huán)穿刺法與腰椎失穩(wěn)法建立椎間盤退變模型[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2011,49(16):22-24.

[4]仇湘中,蔣盛昶,張信成,等. 補肝健腰方對腰椎間盤退變大鼠髓核組織TNF-a.IL-1 }3干預(yù)作用的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,35(4):17-23.

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[7]石鳳英,姜莉.靈芝對大鼠退變椎間盤中白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子α及一氧化氮含量影響的意義[J].中國臨床康復(fù),2006,10(19):56-58.

[8]劉陽,朱立新.細胞因子和炎性介質(zhì)對腰椎間盤退變的作用[J].頸腰痛雜志,2010,31(1):57-58.

Study of the Intervention of Huoxue Jianyao Decoction on TNF-α of the Nucleus Pulposus in Rats with Lumbar Disc Degeneration

Xie-Hongzan Zhang-Xuqiao Qiu-Xiangzhong,et al

Objective The preventive effects of Huoxue Jianyao decoction on TNF-αexpressions in rats with lumbar spine degeneration were observed.The efficacy mechanization of the Huoxue Jianyao decoction in treatment of lumbar disc degeneration was explored. Methods 40 10-month-old SD rats were randomly divided into model group and the sham -operation group, with 30 and 10 respectively. The lumbar spine degeneration models were established by annulus puncture. After the successful modeling, the rats were randomly divided into model group, Huoxue Jianyao decoction group and ibuprofen group, with 8 in each group. The expression levels of TNF-α in nucleus pulposus of lumbar disc tissue were detected after six-month administration. Results The expression of TNF-α in nucleus pulposus of lumbar disc in the model group was increased compared with sham-operation group, and the differences were very significant (P＜0.01);the expression of TNF–α in nucleus pulposus of the lumbar disc in Huoxue Jianyao decoction group were lower than the model group, and the differences were statistically significant (P＜0.01); The level of IL -1β in the ibuprofen group was lower than the model group, and the difference was statistically significant (P＜0.05). Conclusion Huoxue Jianyao decoction can reduce degenerative changes in the lumbar intervertebral disc by inhibition TNF–α in nucleus pulposus of the lumbar disc of rats.

lumbar disc degeneration； Huoxue Jianyao decoction; TNF-α; rats

仇湘中

2011年度湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（2011106），2016年湘潭市科技局立項項目（JZ20161035）