●田斯琦 劉日強(qiáng) 楊華偉

初探在RSK4變異體3的相互作用蛋白

●田斯琦 劉日強(qiáng) 楊華偉

目的：尋找RSK4(核糖體S6蛋白激酶4)第3變異體的相互作用蛋白，以便于為后續(xù)研究其分子機(jī)制及在乳腺癌中的功能做鋪墊。 方法：構(gòu)建RSK4變異體3（RSK4m3）的過表達(dá)慢病毒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，使用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)變異體的蛋白及mRNA的表達(dá)情況，通過質(zhì)譜鑒定找出互作蛋白。結(jié)果：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，RSK4變異體的蛋白及mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，質(zhì)譜結(jié)果分析找出與RSK4m3有相互作用的Creb,insulin,Ppp2c等蛋白。結(jié)論：RSK4m3可能與Creb,insulin,Ppp2c有直接相互作用關(guān)系。

乳腺癌；RSK4;變異體；相互作用蛋白

乳腺癌，一個(gè)人們聞之色變的名詞，根據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]，在中國(guó)每年的新診斷出的乳腺癌病例及死亡病例分別占全球的12.2%和9.6%，這一數(shù)值的持續(xù)升高，加速著我們對(duì)乳腺癌研究的不斷深入。Berns K[2]及SUN Y[3]等人先后證明了，RSK4是抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要因子，它能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其衰老,但對(duì)于其通過mRNA可變剪接作用下行成的RSK4的變異體（RSK4 variants，RSK4m）我們卻知之甚少。RSK4共有3個(gè)剪接變異體[3]，RSK4m3為其的第三變異體，缺失第19外顯子的15個(gè)堿基和第21外顯子，缺失堿基最多，研究也最有意義。本研究旨在尋找RSK4m3的相互作用蛋白，為今后研究其作用機(jī)制及生物學(xué)功能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）細(xì)胞系：人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231于里蘇（上海）生物技術(shù)有限公司購(gòu)買。

（2）主要試劑：Leibovitz’s L-15培養(yǎng)液于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司購(gòu)買；陰性對(duì)照病毒CON145及RSK4m3慢病毒過表達(dá)載體LVRPS6KA6(9076-2)購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；β-actin內(nèi)參和RSK4引物均由華大基因科技服務(wù)有限公司合成；抗RSK4抗體和山羊抗兔二抗購(gòu)自Bioworld公司，GAPDH 抗體及小鼠二抗購(gòu)于上?？党忌锕?。

1.2 方法

（1）構(gòu)建RSK4變異體3的過表達(dá)慢病毒載體：根據(jù)NCBI中RSK4 的cDNA（NM_014496.4）為模板，切除第19外顯子的15個(gè)堿基和第21外顯子，通過PCR擴(kuò)增出RSK4m3的基因，對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收。進(jìn)行搖菌培養(yǎng)后，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，提取RNA進(jìn)行鑒定。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建：將MDA-MB-231細(xì)胞接種至六孔板中，吹打鋪勻，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%的時(shí)候進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，棄上清，放入培養(yǎng)箱。12小時(shí)后取出，去上清，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在24,48,72和96小時(shí)時(shí)觀察熒光蛋白的表達(dá)。設(shè)計(jì)3組，一個(gè)未轉(zhuǎn)染病毒對(duì)照組（con組），一個(gè)轉(zhuǎn)染陰性病毒對(duì)照組（mock組），一個(gè)過表達(dá)RSK4m3慢病毒組（OE組）。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)

通過Primer5.0設(shè)計(jì)出β-actin和RSK4m3的引物序列：

β-actin∶ F 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’, R 5’-C T C C T T A A T G T C A C G C A C G A T-3’; R S K 4 m 3∶F 5’-C A G C C A G T G C A A A T G C T C A T C-3’, R 5’-GGAGCCAACACCAATATCCTC-3’。提取細(xì)胞總RNA，后逆轉(zhuǎn)為cDNA。根據(jù)SYBR Green 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算CT值，以2-△△CT來表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)如下計(jì)算公式，△CT=CT平均值RSK4-CT平均值actin，△△CT=△CTOE-△CTMOCK。

（4）免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)：在細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染72小時(shí)后取出，PBS沖洗3遍提取總蛋白，測(cè)濃度。用聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，以25ug/孔進(jìn)行蛋白上樣，跑近膠底后，以15V的恒壓半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，1h后取出封閉，RSK4一抗（1：1000）4°C孵育過夜，TBST清洗3遍，二抗孵育1小時(shí)。洗膜后發(fā)光，用BIO-RAD化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)分析。

（5）質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析：對(duì)蛋白樣品進(jìn)行電泳，后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，取玻璃板，將膠置于板上，切割蛋白條帶所在位置的膠，放入EP管中。加入三蒸水，震蕩10min（700rpm）3次。加入脫色液，振蕩直至無色。后加入三蒸水（1ml）振蕩10min重復(fù)3次，使用純乙腈脫水3次。按0.5±0.05ug/ul加入typsin,覆蓋干膠，37℃振蕩過夜。吸取酶解液至新管，將提肽液放入EP管將其覆蓋，超聲振蕩20min，吸出液體與酶解液混合，混勻液置于真空干燥儀，直至完全干燥。樣品除鹽，后進(jìn)入C18反相柱，以0.5ul/min流速分離，繼而依據(jù)設(shè)定的線性梯度分離，大于90min.終樣品由LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀鑒定。

（6）對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析：根據(jù)uniprot找出蛋白編號(hào)，進(jìn)行IPA分析并繪制了相應(yīng)的蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

（7）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均以均數(shù)`x±s表示，采用t檢驗(yàn)，p＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

（1）RSK4m3mRNA的表達(dá)：PCR結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.024＜0.05,t=6.379）。（圖1）

圖1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RSK4變異體的mRNA的過表達(dá)檢測(cè)

（2）RSK4m3的蛋白表達(dá)：免疫印跡結(jié)果顯示，RSK4蛋白在con組和mock組中表達(dá)量極低，僅在轉(zhuǎn)染了變異體慢病毒的OE組中表達(dá)增強(qiáng)。（圖2）

（3）經(jīng)串聯(lián)親和純化后的質(zhì)譜鑒定及生物學(xué)分析：經(jīng)過分析，我們發(fā)現(xiàn)RSK4m3與Creb,insulin,Ppp2c有相互作用。（圖3）

圖2 rsk4變異體在蛋白水平過表達(dá)的檢測(cè)

圖3 RSK4變異體相互作用蛋白的網(wǎng)絡(luò)分析圖

3 討論

乳腺癌是威脅全球婦女身心健康的重大疾病，每年都有超過100萬的女性患上該病，并且約有41萬人死于次病[4]。RSK4對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響，針對(duì)該因子的其變異體的研究，我們可以得到新的診斷指標(biāo)，對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)速度，惡性程度，發(fā)展趨勢(shì)及病程結(jié)果預(yù)測(cè)有更精確的判斷能力，使我們可以根據(jù)個(gè)體情況制定更有針對(duì)性的治療靶點(diǎn)提高治療特異性。

（作者單位：廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院）

[1] 李媛秋. 中國(guó)癌癥發(fā)病率預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)方法研究[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2011.

[2] K B, E H, J M, et al. A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of the p53 pathway[J]. Nature,2004(428)∶431-437.

[3] Sun Y, Cao S, Yang M, et al. Basic anatomy and tumor biology of the RPS6KA6 gene that encodes the p90 ribosomal S6 kinase-4[J]. Oncogene,2013,32(14)∶1794-1810.

[4] L Fan，K Strasser-Weippl，Jj Li. Breast cancer in China[J]. Lancet Oncol,2014(15)∶279-289.

田斯琦，女，碩士，研究方向?yàn)槿橄侔┑呐R床與基礎(chǔ)研究。