楊鼎元，楊春燕，羅　充，吳佳海,，曾慶飛

(1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽　550003； 2.貴州草業(yè)研究所，貴州 貴陽　550006)

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航天誘變黔草1號高羊茅內(nèi)生真菌分布特點及分離培養(yǎng)研究

楊鼎元1，楊春燕2，羅充1，吳佳海1,2，曾慶飛2

(1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550003； 2.貴州草業(yè)研究所，貴州 貴陽550006)

摘要：為探明內(nèi)生真菌在航天誘變材料黔草1號高羊茅中的分布情況和種類，利用光學(xué)顯微鏡進行鏡檢觀察，對被侵染的航天誘變材料高羊茅展開內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的菌絲體普遍存在于試驗材料的葉片、葉鞘、莖節(jié)間，內(nèi)生真菌侵染率大小為：莖節(jié)>葉鞘>葉片，侵染差異在航誘材料與對照間(未經(jīng)航天誘變的原始材料黔草1號)差異不顯著(P>0.05)；對分離條件優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)從試驗材料中分離的內(nèi)生真菌在pH 7.5，25℃黑暗培養(yǎng)的條件下以添加高羊茅煎煮液的馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基PSA的培養(yǎng)效果最佳；在pH 7.5，25℃紫外光照/黑暗交替培養(yǎng)的條件下以添加高羊茅煎煮液的水瓊脂培養(yǎng)基WSA的促孢效果最佳。

關(guān)鍵詞：航天誘變；高羊茅；內(nèi)生真菌；侵染檢測；分離培養(yǎng)

內(nèi)生真菌(Endophytic)是一類在植物組織內(nèi)部完成部分或全部生活史，并且在這個過程中不會引起宿主組織表現(xiàn)出明顯病變的微生物類群[1]，目前，國內(nèi)外禾本科植物的內(nèi)生真菌研究主要是在Epichloё屬和Neotyphodium屬真菌中展開，而這兩屬真菌被統(tǒng)稱為Epichloёendophytes[2]，它們在與宿主植株長期的生活中形成了一種互利共生的關(guān)系，禾本科內(nèi)生真菌與宿主間的互利關(guān)系主要表現(xiàn)在2個方面：一方面內(nèi)生真菌寄居在宿主的細胞間隙營寄生生活，另一方面內(nèi)生真菌可以通過分泌各類激素等來促進宿主的生長，亦可分泌生物堿來保護宿主免遭昆蟲、牲畜的采食，進而達成內(nèi)生真菌與宿主互惠互利的共生關(guān)系[3-4]。內(nèi)生真菌作為一種極具開發(fā)價值的新型微生物資源日益受到重視，繼美國、新西蘭之后，阿根廷、西班牙、意大利等國[5-9]也陸續(xù)展開了以內(nèi)生真菌為側(cè)重的研究，并被廣泛應(yīng)用于牧草、草坪草的改良以及水土保持等領(lǐng)域，目前，國外已培育出具有抗病蟲害,但對家畜無毒的多年生黑麥草(Loliumperenne)、高羊茅(Festucaarundinacea)等牧草-內(nèi)生真菌共生體新品種[10]；美國的部分機場通過使用內(nèi)生真菌所分泌的次生代謝產(chǎn)物獲得抗鳥采食特性的新型草坪草種“Avanex”，極大的降低了飛機在起飛、降落等過程中因飛鳥撞擊或引擎吸入而導(dǎo)致的安全隱患及經(jīng)濟損失[11]。

以貴州草業(yè)研究所選育的國審高羊茅品種黔草1號經(jīng)“實踐八號”育種衛(wèi)星搭載處理后返地栽培的航空誘變材料為研究對象，并以未搭載黔草1號為對照，分析航空誘變對內(nèi)生真菌在高羊茅中的分布是否產(chǎn)生影響，并開展內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)研究，旨在探明高羊茅航天誘變材料的內(nèi)生真菌分布情況、建立優(yōu)化內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)體系、分離培養(yǎng)出具有科研價值和研究意義的內(nèi)生真菌種類，為培育優(yōu)質(zhì)內(nèi)生真菌-高羊茅共生體新品系提供參考。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1供試材料分別在2013年10月和2014年5月采集黔草1號(對照)高羊茅及其航天誘變材料(經(jīng)試驗表明[12]該航誘材料屬節(jié)水型變異)各134份。挑選健康植株的葉片、葉鞘、莖節(jié)，放入無菌保鮮袋冷藏保存。

1.1.2試劑苯酚，乳酸，甘油，苯胺藍，孟加拉紅，氫氧化鈉，蒸餾水；75%乙醇，次氯酸鈉(2%有效氯)，馬鈴薯，瓊脂，蔗糖，麥芽浸膏，蛋白胨。

1.2試驗方法

1.2.1內(nèi)生真菌鏡檢參考文獻[13]的內(nèi)生真菌染色鏡檢方法進行。

1.2.2分離培養(yǎng)基參考文獻[14-15]的方法配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)、麥芽浸膏培養(yǎng)基(MEA)；高羊茅煎煮液：取新鮮高羊茅20 g切成5 cm小段，加入1 000 mL蒸餾水，煮沸20 min，煎煮液以雙層紗布過濾，再以蒸餾水補至1 000 mL。配制PDA和WA時以高羊茅煎煮液代替蒸餾水使用，以制作高羊茅煎液馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基(PSA)和高羊茅煎液水瓊脂培養(yǎng)基(WSA)。

1.2.3溫度對內(nèi)生真菌生長的影響用接種環(huán)(直徑為5 cm，下同)將分離純化的內(nèi)生真菌接種至自然pH的PDA平板，分別在8種溫度梯度(13、16、19、22、25、28、31、34℃)下黑暗培養(yǎng)，每周測量菌落直徑。

1.2.4酸堿度對內(nèi)生真菌生長的影響用接種環(huán)將分離純化的內(nèi)生真菌接種至PDA平板，分別在pH 3.5、5.5、7.5、9.5、11.5梯度25℃黑暗培養(yǎng)，每周測量菌落直徑。

1.2.5培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌生長的影響用接種環(huán)將分離純化的內(nèi)生真菌接種至PDA、MEA、WA、PSA、WSA等5種pH 7.5的培養(yǎng)基中25℃下黑暗培養(yǎng)，每周測量菌落直徑。

1.2.6光照條件和培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌產(chǎn)孢量的影響用接種環(huán)將分離純化的內(nèi)生真菌接種至PDA、MEA、WA、PSA、WSA等5種pH 7.5培養(yǎng)基中，25℃下24 h光照培養(yǎng)、黑暗培養(yǎng)、12 h光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)試驗結(jié)束后進行孢子量的測定。

1.2.7內(nèi)生真菌顯微形態(tài)參考文獻[16]的方法，挑取菌落邊緣菌絲，制作水浸片在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對試驗結(jié)果進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌侵染情況

在試驗組和對照組高羊茅的葉片、葉鞘、莖節(jié)中均觀測到內(nèi)生真菌菌絲體，且形態(tài)(分布)特征較為一致。貼著細胞壁生長，多數(shù)平行于宿主細胞的長軸，單行排列在細胞間隙中，粗細比較均勻幾乎沒有分叉，局部偶見彎曲，不穿透宿主細胞。內(nèi)生真菌在葉片中沿著海綿組織的延長方向生長，且多在氣孔附近；在葉片和葉鞘中則較為稀疏，葉鞘中菌絲體沿著葉脈平行的方向排列，縱向生長；莖節(jié)間菌絲體靠近維管束，呈不規(guī)則的排列，且分布比較密集，常形成致密網(wǎng)狀(圖1)。

圖1　高羊茅中的內(nèi)生真菌(40×10)Fig.1　Entophytic fungi of Festuca arundinacea(40×10)

通過對試驗材料的葉片、葉鞘、莖節(jié)等組織的鏡檢觀察統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌對莖節(jié)的侵染最多，在葉鞘的侵染較多，在葉片中的侵染最少(表1)，在不同部位兩兩之間均達到顯著差異(P<0.05)。

收集于2個時期(5月和10月)的試驗材料，5月采集的樣品的葉片、葉鞘和莖節(jié)的內(nèi)生真菌侵染率更高(同10月收集的樣品相比)。經(jīng)過方差分析(表2)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的侵染率，在兩個時期的試驗材料的不同部位間均差異顯著(P<0.05)。

表1　內(nèi)生真菌在航天誘變高羊茅不同組織的侵染

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)

2.2.1分離條件優(yōu)化為達到最佳的內(nèi)生真菌分離效果，對分離材料的表面消毒時間進行優(yōu)化(表3)，75%乙醇和2% NaClO對試驗材料不同組織的消毒時間不同，分離內(nèi)生真菌的分離率亦會有差異，但隨著滅菌時間的增加，其內(nèi)生真菌分離率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。

表2　不同時間采集高羊茅的內(nèi)生真菌侵染

2.2.2溫度和酸堿度對內(nèi)生真菌的影響在最優(yōu)的分離條件下，以鏡檢到內(nèi)生真菌侵染的植株為材料，采用PDA培養(yǎng)基，自然pH進行內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)，待分離的內(nèi)生真菌菌株經(jīng)純化后展開內(nèi)生真菌的溫度優(yōu)化培養(yǎng)研究(表3)。

表3　航天誘變高羊茅中不同組織的內(nèi)生真菌分離結(jié)果

分離到的內(nèi)生真菌在13～34℃均可以生長，但在22～28℃生長情況較佳，菌落生長量由高到低的溫度條件依次為：25℃>22℃>28℃>19℃>16℃>31℃>13℃>34℃，其中，在25℃的溫度條件下培養(yǎng)3周后菌落直徑顯著高于其他溫度梯度下的菌落直徑(P<0.05)，為最適生長溫度(表4)。在相同溫度條件下，菌落直徑均隨時間而增長，且各溫度條件下不同時期(1～3周)間菌落直徑差異顯著(P<0.05)。

在25℃的最適溫度條件下，展開內(nèi)生真菌的pH優(yōu)化培養(yǎng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的內(nèi)生真菌在pH5.5～9.5可以生長較好，當培養(yǎng)菌株的pH為3.5時，在培養(yǎng)的第1周完全觀察不到菌株的生長，但在培養(yǎng)的第2周即開始生長，表現(xiàn)出分離的內(nèi)生真菌具有一定的耐酸性；當培養(yǎng)菌株的pH 11.5時，菌株生長緩慢且在培養(yǎng)的前兩周幾乎不生長；當培養(yǎng)菌株的pH 7.5時，所培養(yǎng)的菌落直徑顯著(P<0.05)高于其他pH梯度下的菌落直徑，為最適生長pH(表5)。

表4　不同溫度下菌落直徑

注：同列數(shù)字不同字母a、b、c，同行數(shù)字不同字母a′、b′、c′，均表示差異顯著(P<0.05),下同

2.2.3培養(yǎng)基種類對內(nèi)生真菌生長和產(chǎn)孢量的影響在25℃和pH 7.5條件下，采用PDA、MEA、WA、PSA、WSA等5種培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌培養(yǎng)3周，均能使分離菌株生長，菌落的生長量從高到低為：PSA>PDA>MEA>WSA>WA，其中，WA水培養(yǎng)基的菌株培養(yǎng)效果最差；添加高羊茅煎煮液的馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基PSA在3周培養(yǎng)試驗中，所生長的菌株直徑均顯著(P<0.05)大于其他種類的培養(yǎng)基，為培養(yǎng)分離菌株的最適培養(yǎng)基(表6)。

表5　不同pH下菌落直徑

表6　不同培養(yǎng)基下培養(yǎng)菌落直徑

以紫外光照條件和PDA、MEA、WA、PSA、WSA等5種培養(yǎng)基進行內(nèi)生真菌的促孢優(yōu)化培養(yǎng)，WSA，WA和MEA都可以誘導(dǎo)分離菌株產(chǎn)孢，其中WSA和

WA在全黑暗培養(yǎng)和全紫外光照射條件下均產(chǎn)孢，而在紫外光照/黑暗交替培養(yǎng)條件下，WA和WSA產(chǎn)孢量同全黑暗培養(yǎng)和全紫外光照射條件下相比增多，MEA培養(yǎng)基亦開始產(chǎn)孢(表7)。

表7　不同光照條件下的促孢結(jié)果

注：+++產(chǎn)孢較多，++產(chǎn)孢多，+產(chǎn)孢少，-不產(chǎn)孢

2.2.4從不同材料中分離培養(yǎng)的內(nèi)生真菌以最佳培養(yǎng)條件對前期鏡檢到內(nèi)生真菌侵染最多的高羊茅組織(莖節(jié))進行分離培養(yǎng)。結(jié)果表明從150個黔草1號高羊茅的莖節(jié)組織塊中分離到了33個菌落，分離率達22.00%，從150個高羊茅航天誘變材料的莖節(jié)組織塊中分離到了29個菌落，分離率達19.33%。經(jīng)促孢培養(yǎng)，從黔草1號分離的菌落有24.24%產(chǎn)孢，航誘材料分離的菌落有27.58%產(chǎn)孢，部分菌落及孢子形態(tài)見圖2、3。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)在高羊茅黔草1號及其航天誘變材料的莖節(jié)、葉鞘和葉片中普遍存在內(nèi)生真菌，從鏡檢的結(jié)果分析對照組和試驗組中的內(nèi)生真菌侵染率差異不顯著(P>0.05)，且這些內(nèi)生真菌的分布特點類似。在莖節(jié)中菌絲不規(guī)則分布在莖組織細胞間隙，葉鞘中的菌絲縱向與葉軸平行，在葉片中的菌絲體分布于葉肉細胞間隙并靠近氣孔，這與Latch[1]，Schardl[17-18]和ZHAO等[19]報道的Epichloё內(nèi)生真菌的菌絲體主要分布在莖節(jié)、葉鞘、葉片等組織中，且在莖節(jié)、葉鞘中分布較多，葉片中分布較少[13,17,19]的結(jié)論一致。此外，研究通過顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌在5月的春夏季對比于同年10月，內(nèi)生真菌對相同宿主的侵染后的鏡檢觀察率更高，達極顯著差異(P<0.01)，有研究報道春夏季節(jié)內(nèi)生真菌的活性更高[20-21]，春夏時節(jié)對比其他季節(jié)內(nèi)生真菌比較活躍，故而對于內(nèi)生真菌的相關(guān)研究應(yīng)盡量在這個時間展開。

圖2　高羊茅黔草1號分離菌株及其孢子形態(tài)(40×10)Fig.2　Cultivation of endophytic fungi colony and spores of QianCaoNO.1

圖3　航天誘變高羊茅分離菌株及其孢子形態(tài)(40×10)Fig.3　Cultivation of entophytic fungi colony and spores of aerospace mutation

對分離的內(nèi)生真菌培養(yǎng)研究后發(fā)現(xiàn)，這些內(nèi)生真菌適合黑暗培養(yǎng)且在低于13℃和高于32℃時生長緩慢，其最適生長溫度為25℃，這與分離寄主高羊茅的適宜生長溫度符合，且與其他國內(nèi)外研究者的結(jié)論相似[1,22-23]；在pH 5.5～9.5的PDA培養(yǎng)基上均可生長，培養(yǎng)的最佳pH 7.5，說明這些內(nèi)生真菌具備一定的酸耐受能力；相同生長條件下，這些內(nèi)生真菌在PDA的改良培養(yǎng)基PSA上的生長情況最好，可能的原因是后者所添加的高羊茅煎煮液具備某種促進內(nèi)生真菌生長的物質(zhì)。同時，這些內(nèi)生真菌在12 h光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)條件下的WA、WSA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量高于其他3種，而添加了高羊茅煎煮液的WSA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量又比WA培養(yǎng)基高，一方面有研究報道這是處于富營養(yǎng)時菌株優(yōu)先營養(yǎng)生長，當生長環(huán)境下營養(yǎng)匱乏時菌株優(yōu)先形成孢子[15,24]，因此，菌株生長狀況良好的PDA，PSA和MEA培養(yǎng)基進行促孢實驗時效果較差；另一方面可能是由于紫外光改變和破壞結(jié)構(gòu)突變，改變了細胞的遺傳轉(zhuǎn)錄特性作用，這種紫外燈(交替)照射處理給人工培養(yǎng)在單純且均一環(huán)境下菌株一定的環(huán)境脅迫，協(xié)同WA(WSA)培養(yǎng)基一同抑制了菌絲體的營養(yǎng)生長，故而促進了菌株的繁殖，大量產(chǎn)孢[25-26]。

試驗從黔草1號高羊茅及其航天誘變材料中均分離到內(nèi)生真菌菌株，這些菌株的培養(yǎng)性狀表現(xiàn)出一定的差異。從黔草1號中分離到的菌株中央平坦，正面多呈灰、褐色，背面為棕色，氣生菌絲氈狀或絮狀，邊緣整齊或輻射狀(圖2)；從航天誘變材料中分離到的菌株中央凸起，正面多白色，背面為褐色，氣生菌絲氈狀或絮狀，邊緣輻射狀(圖3)。此外，這些菌株的孢子形態(tài)較為一致，將其初步鑒定為麥角菌科香柱菌屬[27-28]，但體外培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌落形態(tài)具有極大的多樣性[1,13]，因此在進一步研究前應(yīng)該通過分子技術(shù)對其進行更為客觀的鑒定。

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Distribution characteristics of entophytic fungi in tall fescue with aerospace mutation and its cultivation research

YANG Ding-yuan1，YANG Chun-yan2，LUO Chong1，WU Jia-hai2,ZENG Qing-fei2

(1.GuizhouNormalUniversity，GuiyangGuizhou，Guiyang550006，China；2.GuizhouIntituteofPrataculture,Guiyang550003，China)

Abstract：For clarifying the distribution and types of entophytic fungi in tall fescue (Qiancao NO.1) with aerospace mutation,the study firstly observed by optical microscopy and then conducted isolated culture to entophytic fungi of the tall fescue. The results showed that mycelium of entophytic fungi were widespread existed in the leaf,leaf sheath and pith internode ,the rank of entophytic fungi infection rate was pith > leaf sheath > leaf,but,there was no significant difference of infection rate between aerospace mutation sample and non- aerospace mutation sample (P>0.05);the optimal culture condition was pH 7.5,25 ℃ under light/dark alternate training and WSA media with tall fescue decoction liquid water.

Key words：aerospace mutation;tall fescue;entophytic fungi;infection detection;separation of culture

中圖分類號：Q 948；S 54

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5500(2016)02-0021-06

作者簡介：楊鼎元(1989-)，男，貴州赫章人，在讀碩士研究生。

基金項目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金“貴州高羊茅內(nèi)生真菌資源及其多樣性研究”(黔科合J字[2012]2202號)；貴州師范大學(xué)研究生創(chuàng)新基金[研創(chuàng)2013(13)]資助

收稿日期：2015-12-23； 修回日期：2016-03-07

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吳佳海為通訊作者。