高炳諫 廖小鳳 甘潔紅

亞甲藍光化學法病毒滅活血漿的制備應用探討

高炳諫 廖小鳳 甘潔紅

目的 探討亞甲藍光化學法(MB-P)病毒滅活前后新鮮冰凍血漿中凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纖維蛋白原(Fib)和總蛋白(TP)、亞甲藍濃度及血漿容量的變化，為臨床應用病毒滅活血漿提供依據。方法 隨機抽取2015年7月～12月(每月10份)60份新鮮血漿，分成兩組，一組進行病毒滅活，一組不滅活，滅活前后留樣，制成新鮮冰凍血漿，48小時后融化，分別對病毒滅活前后血漿中的凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纖維蛋白原(Fib)和總蛋白(TP)的含量進行測定，并檢測病毒滅活前后血漿中亞甲藍濃度和稱取病毒滅活過濾MB前后血漿的重量，同時計算有效成分的回收率。結果 經病毒滅活后新鮮冰凍血漿中凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纖維蛋白原(Fib)和總蛋白(TP)的含量及亞甲藍濃度、血漿重量明顯降低，各項指標均有顯著變化，P<0.01，差異均有統(tǒng)計學意義, 凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纖維蛋白原(Fib)和總蛋白(TP)回收率分別為84.81%、82.46%和93.76%，亞甲藍的清除率可達83.93%,血漿回收率為93.97 %。結論 經MB-P病毒滅活血漿能提高血漿輸注的安全性，同時，血漿中的有效成分及容量也有一定程度的損失，應加強從采血到血漿病毒滅活各環(huán)節(jié)的冷鏈及時間控制，嚴格按操作規(guī)程操作，保證原料血漿的有效成分處于較高水平。

亞甲藍光化學法; 病毒滅活; 新鮮冰凍血漿; 凝血因子

隨著臨床輸血技術的發(fā)展，血漿成分輸注的比例不斷提高,輸注血漿成為臨床上治療各種疾病的重要治療手段之一，盡管血液檢測的水平不斷提高，血液的輸注仍存在著風險，原因是由于現有的檢測方法具有一定的局限性，還不能檢出少數血液中感染的病毒和微生物，尤其是對于“窗口期”的血液，漏檢的可能性很大[1]，同時還有未知病毒不為人們所了解以及一些可能通過輸血傳播的病毒還未列入常規(guī)檢測項目，也威脅著血液的安全。亞甲藍光化學法(MB-P)是目前我國唯一獲準用于臨床的光化學血漿病毒滅活技術[2-3]。為了解我站病毒滅活血漿的質量，筆者對病毒滅活前后新鮮冰凍血漿的凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纖維蛋白原(Fib)和總蛋白(TP)的含量及亞甲藍濃度、血漿重量的抽樣檢測結果進行比較分析，探討影響病毒滅活血漿前后主要成分變化的相關因素及采取的相應措施，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

隨機抽取本站2015年7月～12月(每月抽10袋)采集的60袋400 ml全血，于采后6～8 h內(3 800轉/分、10 min、4 ℃)離心，分離出上層血漿并以同樣的轉速、時間、溫度再次離心，去除殘余紅細胞，制備成新鮮血漿，210～260 ml/袋，然后在百級凈化間內按無菌操作將一次性使用病毒滅活輸血過濾器的針頭穿刺連接血漿袋，使血漿緩慢通過亞甲藍扣流入病毒滅活過濾器的一個空袋，當血漿袋剩下約6 ml時熱合，作為病毒滅活前血漿樣本備檢。將加入亞甲藍的血漿輕輕混勻后放入血漿病毒滅活箱內進行光照處理，設置光照強度為30 000～35 000 Lx，溫度為2～8 ℃，擺動頻率為60次/分，照射時間為35 min，光照完畢后打開MB過濾器管道上的夾子讓血漿緩慢通過過濾器濾除亞甲藍(注：將過濾前、后的血漿袋稱重)，制備成病毒滅活后血漿，混勻留樣6 ml備檢，將病毒滅活前、后留樣標本立即置-50 ℃速凍機速凍1 h后，放在-20 ℃以下冰箱凍存48小時，待檢測。

1.2 主要儀器與試劑

6000i大容量低溫離心機、全自動生化分析儀、全自動血凝分析儀、722s可見光光度計、固相萃取儀、百級凈化間、病毒滅活箱和一次性使用病毒滅活輸血過濾器、凝血因子Ⅷ(FⅧ)檢測試劑、纖維蛋白原檢測試劑、總蛋白檢測試劑、亞甲藍濃度測定試劑。

1.3 檢測方法

將凍存48小時后的血漿樣本放在37 ℃水浴中解凍，凝血因子Ⅷ(FⅧ)的含量檢測應用凝固法，采用血凝儀測定；總蛋白的檢測應用雙縮脲法，采用全自動生化分析儀測定，嚴格按照試劑和儀器使用說明書的要求操作，以滅活后含量/滅活前含量計算有效成分保有率。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

病毒滅活后血漿中的FⅧ、Fib、TP均低于病毒滅活前，回收率分別為84.81%、82.46%和93.76%，病毒滅活過濾后血漿容量回收率為93.97%，亞甲藍的清除率可達83.93%,組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值<0.05)，但均符合GB18469-2012《全血及成分血質量要求》的相關標準，病毒滅活前后血漿相關指標變化見表1。

項目滅活前滅活后回收率/去除率%t值P值Ⅷ因子(IU/ml)0.79±0.130.67±0.1284.8±0.184.81<0.01纖維蛋白原(mg/ml)2.11±0.211.74±0.0982.46±0.2211.93<0.01總蛋白(g/L)59.48±4.2255.77±4.1993.76±6.34.15<0.01血漿容量(g)237±14.58222.7±12.8893.97±5.5613.74<0.01亞甲藍濃度(umol/L)1.12±0.180.18±0.0883.93±0.073.16<0.01

3 討論

血漿是一種臨床需求量大，攜帶病毒風險較高的血液制品。受檢測項目和檢測手段的限制，處于“窗口期”的病毒攜帶者可出現漏檢，無法完全阻斷經血液傳播疾病的發(fā)生，因此對血漿進行病毒滅活處理，對于降低由此導致的病毒感染危險是非常重要的。近年來，臨床上加大了對血漿病毒滅活的臨床研究，并取得了較大的進展。亞甲藍光化學法(MB-P)是一項成熟的血漿病毒滅活技術[4]，這一病原體滅活技術已在我國及部分歐洲國家廣泛應用于臨床[5-6]。亞甲藍是一種帶正電荷的感光吩噻嗪小分子化學物，其病毒滅活血漿的機制是亞甲藍光化學法產生的單線態(tài)氧對病毒核酸、膜蛋白、臘脂都會造成損傷，光激活產生的自由基(比如羥自由基)可導致DNA單鏈斷裂，從而使病毒完全失去穿透、復制及感染能力[7]，達到滅活病毒的目的。

本次研究表明，血漿病毒滅活前、后有效成分的含量發(fā)生改變，不穩(wěn)定凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纖維蛋白原(Fib)、總蛋白(TP)的含量明顯降低，回收率為84.81%、82.46%和93.76%，差異有統(tǒng)計學意義，雖然符合國家質量標準允許范圍內(新鮮冰凍血漿疑血因子Ⅷ(FⅧ)含量≥0.7 IU/ml；病毒滅活新鮮冰凍血漿凝血因子Ⅷ(FⅧ)含量≥0.5 IU/ml；總蛋白含量≥50 g/L)。但低于文獻[6-8]報道的病毒滅活前后血漿的有效成分的含量，這可能與病毒滅活血漿因光照、吸附、過濾等原因有關外，還說明我站從采血到血漿制備病毒滅活血漿整個過程的冷鏈和時間還未得到有效控制，因為，血漿中有效成分的含量易受血液采集、運輸、保存等環(huán)節(jié)的溫度、時間及制備方法、制備條件、儲存溫度等過程質量的影響[9-10]，因此，我站必須加強采血、制備工作人員的質量意識和操作技能的培訓，必須嚴格控制好從血液采集至血液制備成病毒滅活血漿整個過程的冷鏈和時間，以保證滅活前血漿的有效成分處于較高水平，保證臨床輸注病毒滅活血漿的安全和有效。

表1結果顯示，病毒滅活過濾后，血漿容量回收率為93.97%，血漿平均損失量約為15 ml,但在60份標本中，也有8份標本血漿損失量超過20 ml，這可能與個別工作人員操作使導管及過濾器殘留過多血漿有關，因此，工作人員特別是新進人員應加強技能操作練習，在操作中應盡量排盡導管及過濾器的血漿到血漿袋中，降低過濾管道和過濾器的殘余血漿量，還要在原料血漿上按標士量浮動范圍增加約15 ml，以保證病毒滅活后血漿的容量達到標準。

本實驗加入MB的濃度為1.12±0.18 umol/L,基本滿足了血漿病毒滅活的要求。同時，對濾除后的亞甲藍殘留量進行測定，發(fā)現僅為0.18±0.08，去除率達到83.93%，低于我國國標《全血及成分血質量要求》(GB18469-2012)中對MB-FFP規(guī)定的MB殘留量≤0.3 umol/L的要求[11]。但在60份標本中，有2份MB殘余量>0.3 umol/L，這可能是個別工作人員操作不按操作規(guī)程進行操作，把未連接過濾器的管道夾子過早打開或過濾器的質量影響有關，盡管MB在病毒滅活過程中的劑量已被證實是安全的，但也有研究指出，MB可能有致突變和引發(fā)過敏的風險[13]，因此，加強對MB殘留量指標的監(jiān)測，嚴格按照病毒滅活血漿操作規(guī)程進行過濾，盡量減少由于MB殘留可能引起的潛在風險，進一步保障輸血安全。

綜上所述，經過病毒滅活過程對血漿中的有效成分均有一定程度的損失，作者建議，用于制備冷沉淀的原料新鮮冰凍血漿不需進行病毒滅活處理，以免影響冷沉淀的質量，臨床病人輸注病毒滅活血漿時，根據病情需要，適當增加血漿用量，以保證療效。為了保證病毒滅活后血漿的質量和病毒滅活血漿能夠順利推廣應用，應對采供血工作人員進行病毒滅活相關理論知識及操作技能的培訓考核，加強工作人員從采血到血液制備整個過程的各項標準操作規(guī)程的培訓，加強從血液采集、儲存、運輸到病毒滅活血漿凍存全過程的冷鏈和時間控制，以保證輸血安全的同時確保血漿的成分和療效。加強臨床醫(yī)護人員對成分輸血、輸血安全性等相關知識的培訓，增強輸血安全意識，共同做好新產品推廣應用工作，提高輸血安全性。

[1] 聶詠梅，血漿病毒滅活研究進展[J].國外醫(yī)學病毒學分冊，2003，10(5)：146-150.

[2] 王 飛，路志浩，古醒輝，等.亞甲藍光化學法血漿病毒滅活前后血漿成分的變化[J].臨床輸血與檢驗，2010，12(2):97-100.

[3] 于建華，王明靜.病毒滅血漿若干問題探討[J].中國現代醫(yī)生，2010，48(12):19-22.

[4] 王紅蘋，趙樹銘.亞甲藍滅活血漿病毒的臨床應用進展[J].中國輸血雜志，2014，27(12)：1361-1363.

[5] 葉露露，單桂秋，馬 靜，等.亞甲藍光化學法病毒滅活冷沉淀的制備及初步評價[J].華南國防醫(yī)學雜志，2014，28(9):858-859.

[6] 張 博，王露楠，黃宇聞，等.丙型肝炎病毒樣顆粒作為亞甲藍學化學法滅活HCV效果評價物的可行性研究[J].中國輸血雜志，2015，28(1):14-17.

[7] 劉仁強，秦艷蘭，何子毅,等.亞甲蘭光化學法對FFP中凝血因子及總蛋白含量的影響[J].中國輸血雜志，2010，23(6)：436-438.

[8] 宋飛峰，李竹蘭，楊 瑩.病毒滅活過程對血漿成分影響的臨床研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2015，25(9):1943-1944

[9] 陳鎮(zhèn)周，肖明星，陳湘屏，等.亞甲藍光化學法病毒滅活對血漿質量的影響[J].中國輸血雜志，2011，24(06):490-492.

[10]王超英.亞甲藍光化學法病毒滅活對血漿成分及白細胞殘留量的影響[J].臨床輸血與檢驗，2014，16(3):290-292

[11]中華人民共和國國家質量標準.全血及成分血質量要求.GB18469-2012[S].中國標準出版社.2012.

[12]楊春暉，邊國慧，陽 紅,等.病毒滅活血漿中MB殘留量檢測[J].中國生物制品學雜志，2015，28(4):426-428.

R457.1+4

A

10.3969/j.issn.1671-332X.2016.10.026

高炳諫 廖小鳳 甘潔紅 ： 云浮市中心血站 廣東云浮 527300