趙 鐸， 金 柱， 宋亞亞， 高寶安

(三峽大學(xué)呼吸病研究所，宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸科，湖北 宜昌 443003)

miRNA-181a在人肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞功能的影響

趙 鐸， 金 柱， 宋亞亞， 高寶安△

(三峽大學(xué)呼吸病研究所，宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸科，湖北 宜昌 443003)

目的： 研究微小RNA-181a(miRNA-181a)在不同人肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其轉(zhuǎn)染人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP后對(duì)其細(xì)胞功能的影響及機(jī)制。方法: 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miRNA-181a在人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺腺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP中的表達(dá)；利用pGenesil-miRNA-181a真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和空載組；分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及Western blot法檢測(cè)miRNA-181a轉(zhuǎn)染前后的表達(dá)情況、對(duì)A549/DDP細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲能力和順鉑(DDP)作用下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、細(xì)胞凋亡率的影響以及對(duì)A549/DDP細(xì)胞中miRNA-181a的靶基因bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果: miRNA-181a在A549和A549/DDP中的表達(dá)量顯著低于BEAS-2B(P<0.05)，且在A549/DDP中表達(dá)量最低；miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后其表達(dá)顯著升高(P<0.05)且能夠抑制A549/DDP細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和細(xì)胞侵襲能力(P<0.05)，同時(shí)升高DDP作用下A549/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和細(xì)胞凋亡率(P<0.05)；miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)而促進(jìn)P53蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論: miRNA-181a可能參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，miRNA-181a可作為人肺腺癌治療的新靶點(diǎn)。

微小RNA-181a； A549/DDP細(xì)胞系； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞侵襲

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度一般為18～23個(gè)堿基構(gòu)成的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后能夠調(diào)控目的基因的表達(dá)，參與到細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、發(fā)育和代謝等生理過程中[1]。已有研究報(bào)道[2]，在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了miRNA表達(dá)量的改變，提示其可能參與到腫瘤的發(fā)病機(jī)理中，與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥等相關(guān)，發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用。大量研究表明[3]，miRNA的異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等多種惡性腫瘤中具有重要臨床價(jià)值。miR-181a在多種組織臟器中選擇性的表達(dá)，具有功能多樣、生物學(xué)效應(yīng)顯著等特點(diǎn)。有研究表明[4]miR-181a能夠調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和凋亡，如在急性髓系細(xì)胞白血病細(xì)胞中過表達(dá)miR-181a會(huì)顯著降低細(xì)胞的增殖和代謝活性，而抑制miR-181a表達(dá)對(duì)急性髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞增殖和代謝活性卻沒有產(chǎn)生影響。在人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG對(duì)放射物的敏感性研究中，也發(fā)現(xiàn)輻射處理后的U87MG細(xì)胞Bcl-2發(fā)生上調(diào)，而miR-181a下調(diào)；而過表達(dá)miR-181a則會(huì)下調(diào)Bcl-2蛋白，所以調(diào)控miRNA-181a的表達(dá)對(duì)于臨床治療腫瘤具有重要的參考價(jià)值[5]。肺癌是當(dāng)今腫瘤死亡的重要原因，而其中以非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)為主，這與其容易產(chǎn)生耐藥性有關(guān)[6]。但目前對(duì)于miRNA-181a在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)情況尚不確定，其在NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及耐藥性等細(xì)胞功能中發(fā)揮的作用也未知。因此，本研究選擇人肺腺癌細(xì)胞A549及耐藥A549/DDP為NSCLC細(xì)胞系的研究對(duì)象，檢測(cè)miRNA-181a在不同NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)相關(guān)細(xì)胞功能的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株與試劑

人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺腺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、含0.25% EDTA的胰酶購(gòu)自HyClone；TRIzol提取RNA試劑盒購(gòu)自成都天根公司；NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、OpenArray MicroRNA Real-Time PCR Master Mix購(gòu)自Invitrogen；Transwell Permeable Supports購(gòu)自Corning；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)購(gòu)自Sigma；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司；兔抗人Bcl-2、 P53、β-actin的I抗購(gòu)自Santa Cruz；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG的II抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 分別將購(gòu)買的人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺腺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔12 h后更換新培養(yǎng)基1次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并等細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%以上后進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。將傳代的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-181a的表達(dá) 分別將處于增殖期的BEAS-2B、A549、A549/DDP細(xì)胞經(jīng)含0.25%的胰酶消化后，900 r/min離心5 min后收集細(xì)胞。在各組細(xì)胞中加入1 mL的TRIzol提取液，按照試劑盒步驟提取總 RNA，設(shè)計(jì)合成miRNA-181a莖環(huán)特異逆轉(zhuǎn)錄引物為5’-GTCG-TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA-CGCTCACCG-3’；利用miRNA-181a特異性引物和NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。由Invitrogen設(shè)計(jì)合成miRNA-181a和內(nèi)參照U6實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，miRNA-181a上游引物為5’-GCCGAAACATTCAACGCTATC-3’，下游引物為5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參照U6上游引物為5’-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。利用OpenArray MicroRNA Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明書分別加入miRNA-181a引物或內(nèi)參照U6引物、逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板，置于ABI7300熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。miRNA-181a和內(nèi)參照U6均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，采用2-ΔΔCt方法對(duì)miRNA-181a相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算比較。

2.3 miRNA -181a過表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及檢測(cè) 從miRNAs目標(biāo)靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.mirbase.org)獲得人miRNA-181a基因序列為5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’， 經(jīng)由Invitrogen合成并構(gòu)建帶綠色熒光標(biāo)記的pGenesil-miRNA-181a真核表達(dá)質(zhì)粒。用培養(yǎng)基調(diào)整A549/DDP細(xì)胞濃度為5×108/L，每孔2 mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至50%以上后用于轉(zhuǎn)染。將Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和合成構(gòu)建的miRNA-181a表達(dá)載體以2∶1體積比列混合后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至各孔A549/DDP細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和pGenesil空載組。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并繼續(xù)培養(yǎng)以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后按照上述步驟方法提取各組細(xì)胞中的總RNA， miRNA181a逆轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組A549/DDP細(xì)胞中miRNA-181a表達(dá)的變化。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力和抑制率 將miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后12 h的細(xì)胞(5×107/L)每孔 200 μL接種于96孔板中，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和空載組。先繼續(xù)分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后，在每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基，在每孔中加入150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min后，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度(A)值。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)將miRNA-181a轉(zhuǎn)染24 h的A549/DDP細(xì)胞接種于96孔板中，在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后各組細(xì)胞更換含不同濃度(0、5、10、15、20 μmol/L)順鉑的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后按照相同的方法測(cè)定各組細(xì)胞在570 nm處的A值，并計(jì)算各組細(xì)胞在順鉑作用下的生長(zhǎng)抑制率，按照公式計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-加藥組A值)/未加藥對(duì)照組A值×100%。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 收集miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP 24 h后的各組細(xì)胞經(jīng)PBS重懸后制成單細(xì)胞懸液，先加入70%預(yù)冷的乙醇在4 ℃固定12 h后，離心棄上清并清洗去乙醇，用500 μL的PBS重懸細(xì)胞加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)和RNaseA(50 mg/L)室溫避光孵育30 min后經(jīng)流式細(xì)胞儀上樣測(cè)定各組A549/DDP細(xì)胞周期并計(jì)算各周期百分比。同時(shí)收集miRNA-181a轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，根據(jù)2.4實(shí)驗(yàn)更換含10 μmol/L DDP的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別在各組細(xì)胞中加入細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑(5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和10 μL PI)，37 ℃下避光孵育20 min后，PBS洗滌1次并重懸經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 收集miRNA-181a轉(zhuǎn)染24 h后的A549/DDP細(xì)胞，并用培養(yǎng)基重懸稀釋細(xì)胞濃度為1×108/L，然后每孔200 μL種植于預(yù)先用1 g/L的,Matrigel膠包被的Transwell板上室中，下室中為加入含20%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基600 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。等培養(yǎng)結(jié)束后用4%的多聚甲醛固定小室的濾膜，并擦去上表面的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色液染色10 min后，PBS洗滌3次，在顯微鏡下觀察各組A549/DDP細(xì)胞侵襲穿過濾膜的細(xì)胞，并隨機(jī)拍照計(jì)數(shù)各組細(xì)胞的侵襲率。細(xì)胞侵襲率=(各組平均侵襲細(xì)胞數(shù)/未處理對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。

2.7 Western blot法檢測(cè)miRNA-181a靶基因蛋白的表達(dá) miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞24 h后，消化離心收集細(xì)胞，并用PBS洗滌1次，加入RAPI細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞并提取總蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞中總蛋白濃度。各組取30 μg總蛋白進(jìn)行10%的SDS-PAGE 2 h后，進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉30 min后孵育多克隆兔抗人Bcl-2、P53、β-actin的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌 5 min 3次；然后室溫孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG II抗(1∶5 000)2 h，再用TBST洗滌3次后用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，并曝光掃描拍照，用Quantity One軟件分析各組A549/DDP細(xì)胞中miRNA-181a靶基因蛋白Bcl-2和P53的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析，并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。符合正態(tài)分布兩組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析，用SNK-q進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miRNA-181a在不同細(xì)胞系中的表達(dá)

miRNA-181a在BEAS-2B細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量為1.05±0.03，而A549細(xì)胞中miRNA-181a相對(duì)表達(dá)量顯著下降為0.35±0.06，與BEAS-2B細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；而A549/DDP細(xì)胞中miRNA-181a相對(duì)表達(dá)量也顯著下降為0.13±0.05，與BEAS-2B、A549細(xì)胞系相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of miRNA-181a in different cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsBEAS-2B group;#P<0.05vsA549 group.

圖1 miRNA-181a在BEAS-2B、A549和A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)

2 miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后的表達(dá)情況

上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-181a在A549/DDP細(xì)胞中表達(dá)量最低，為進(jìn)一步研究miRNA-181a對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞功能的影響，將pGenesil-miRNA-181a真核表達(dá)質(zhì)粒通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞中。在倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)miRNA-181a空載組和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞48 h后發(fā)綠色熒光，說明miRNA-181a能夠轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上，而未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中未見綠色熒光。同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后其表達(dá)量顯著增加。與未轉(zhuǎn)染組和空載轉(zhuǎn)染組相比，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組中miRNA-181a表達(dá)量上升約(14.93±0.96)倍(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of miRNA-181a in transfected A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖2 miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后細(xì)胞的表達(dá)變化

3 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染組的A549/DDP細(xì)胞活力受到抑制，顯著低于未轉(zhuǎn)染組和空載組，并呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。當(dāng)DDP濃度為10 μmol/L時(shí)，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率已顯著升高(P<0.05)，但未轉(zhuǎn)染和空載組在DDP作用濃度上升為20 μmol/L時(shí)，其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率才顯著升高，說明miRNA-181a轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，見圖3、4。

4 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后能夠抑制細(xì)胞周期中增殖期(S+G2/M期)比率。與未轉(zhuǎn)染組A549/DDP細(xì)胞相比，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組中A549/DDP細(xì)胞中G0/G1期百分比顯著升高(P<0.05)，而S+G2/M期百分比顯著下降(P<0.05)?？蛰d組中A549/DDP細(xì)胞G0/G1期和S+G2/M期百分比值與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，見圖5。

5 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP在DDP作用下細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在10 μmol/L的DDP作用下各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示miRNA-181a轉(zhuǎn)染組中A549/DDP細(xì)胞的凋亡率為(58.96±4.45)%，明顯高于未轉(zhuǎn)染組和空載組(P<0.05)，見圖6。

6 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell檢測(cè)各組A549/DDP細(xì)胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染能夠降低A549/DDP細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果見圖7。與未轉(zhuǎn)染組和空載組的細(xì)胞相比，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組A549/DDP細(xì)胞的侵襲能力顯著降低(P<0.05)。

Figure 3.The effect of miRNA-181a transfection on the cell activity of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfec-ted group;#P<0.05vsnegative group.

圖3 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞活力的影響

Figure 4.The effect of miRNA-181a transfection on A549/DDP cell growth inhibition rate under DDP treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖4 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞在DDP作用下生長(zhǎng)抑制率的影響

Figure 5.The effect of miRNA-181a transfection on the cell cycle of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖5 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期的影響

Figure 6.The effect of miRNA-181a transfection on the cell apoptosis of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖6 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP在DDP作用下細(xì)胞凋亡的影響

Figure 7.The effect of miRNA-181a transfection on the invasion ability of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖7 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞侵襲能力的影響

7 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞中Bcl-2和P53蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞對(duì)miRNA-181a的靶基因bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果見圖8。與未轉(zhuǎn)染組和空載組比較， miRNA-181a轉(zhuǎn)染組A549/DDP細(xì)胞P53蛋白表達(dá)量顯著升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下降 (P<0.05)。

討 論

miRNA作為一種進(jìn)化上高度保守的小分子RNA，雖然不被翻譯但能夠顯著調(diào)控其它基因表達(dá)，目前miRNA與腫瘤的相關(guān)性研究受到廣泛關(guān)注，而部分miRNA可能成為腫瘤治療新的靶點(diǎn)[7-8]。miRNA-181家族在肝癌、胃癌、乳腺癌、白血病等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮抑癌或促癌的重要作用，并與多種惡性腫瘤的耐藥性、臨床診斷及預(yù)后密切相關(guān)[9]。miRNA-181a是miRNA-181家族中重要成員之一，在基因組中表現(xiàn)進(jìn)化保守性，參與細(xì)胞的分化調(diào)控，它能夠抑制多種細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且在不同組織細(xì)胞中具有表達(dá)差異[10-11]。目前關(guān)于miRNA-181a在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的功能研究尚少見。因此，本研究檢測(cè)miRNA-181a在不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，并利用miRNA-181a真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞，以揭示其在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用。

Figure 8.The effect of miRNA-181a transfection on the protein expression of Bcl-2 and P53 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖8 miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞對(duì)miRNA-181a靶基因蛋白Bcl-2和P53表達(dá)的影響

以往研究表明，miRNA-181a在不同腫瘤中表達(dá)具有差異性，其在乳腺癌、胃癌中表達(dá)量顯著升高，而在口腔鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)[12-13]。本研究為揭示miRNA-181a在人非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)差異，選用人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B為對(duì)照，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-181a在人肺腺癌細(xì)胞A549及耐藥細(xì)胞A549/DDP中表達(dá)量顯著低于BEAS-2B細(xì)胞，說明miRNA-181a在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中低表達(dá)，推測(cè)其可能在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，選擇表達(dá)量最低的A549/DDP為研究對(duì)象并通過轉(zhuǎn)染miRNA-181a，使其在A549/DDP中高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染后能夠抑制A549/DDP細(xì)胞活性，并顯著提高A549/DDP的增殖抑制率，直接說明miRNA-181a在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用，與馮春來等[14]關(guān)于miRNA-181a影響A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的研究具有一致性。

細(xì)胞生長(zhǎng)受到細(xì)胞周期的調(diào)控，細(xì)胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和細(xì)胞分裂暫停期(G0期)，其中S期長(zhǎng)短可以反映細(xì)胞增殖能力強(qiáng)弱[15]。相關(guān)研究[16]表明miRNA均能發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用。本研究中miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后，其G0/G1期顯著增加，但反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的S+G2/M期顯著下降，說明上述miRNA-181a 抑制A549/DDP細(xì)胞活力是其通過阻滯細(xì)胞周期而發(fā)揮作用的。而在低濃度(10 μmol/L) DDP作用下，未轉(zhuǎn)染組和空載組A549/DDP細(xì)胞凋亡率較低，但miRNA-181a轉(zhuǎn)染后其凋亡率顯著上升，說明miRNA-181a提高順鉑作用下A549/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用的。

肺癌細(xì)胞侵襲是其腫瘤惡性的生物標(biāo)志，A549/DDP作為具有多藥耐藥性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，具有較強(qiáng)的侵襲能力[17]。但本研究中，miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其侵襲能力顯著下降，侵襲率為未轉(zhuǎn)染組和空載組的1/3,說明miRNA-181a能夠抑制A549/DDP的侵襲能力。已有研究利用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證bcl-2和p53是miRNA-181a發(fā)揮促凋亡作用的下游靶基因，并能夠被miRNA-181a調(diào)控表達(dá)[18]。為進(jìn)一步研究miRNA-181a對(duì)A549/DDP細(xì)胞功能發(fā)揮作用的機(jī)制，利用Western blot法檢測(cè)miRNA-181a轉(zhuǎn)染對(duì)A549/DDP細(xì)胞中Bcl-2和P53表達(dá)的影響。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因編碼的產(chǎn)物，發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞存活的作用，并能夠抑制細(xì)胞凋亡[19]。而抑癌基因p53是一種抑制細(xì)胞癌變的基因，并是與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，其產(chǎn)物P53蛋白發(fā)揮抑癌作用[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后，細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)顯著下降而P53蛋白表達(dá)上升，說明miRNA-181a能夠通過抑制A549/DDP細(xì)胞Bcl-2表達(dá)且促進(jìn)P53表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，本研究證實(shí)miRNA-181a在人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞中低表達(dá)且以A549/DDP為甚，而高表達(dá)miRNA-181a可抑制A549/DDP的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、侵襲能力，提高順鉑作用下的生長(zhǎng)抑制率和凋亡率，作用機(jī)制可能與抑制Bcl-2蛋白且促進(jìn)P53蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究表明miRNA-181a在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用，其可能會(huì)成為非小細(xì)胞肺癌治療的新靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Expression of miRNA-181a in human lung adenocarcinoma cells and its effect on cell function

ZHAO Duo, JIN Zhu, SONG Ya-ya, GAO Bao-an

(InstituteofRespiratoryDisease,ChinaThreeGorgesUniversity,DepartmentofRespiration,YichangCentralPeople’sHospital,Yichang443003,China.E-mail: 222xiaozhao@163.com)

AIM: To study the expression of microRNA (miRNA)-181a in different human lung adenocarcinoma cell lines, and to investigate the effect of miRNA-181a on cell function and its mechanism in human lung adenocarcinoma drug resistant cell A549/DDP. METHODS: Real-time PCR was used to detect the expression of miRNA-181a in BEAS-2B cells, A549 cells and A549/DDP cells. The A549/DDP cells were transfected with pGenesil-miRNA-181a eukaryotic expression plasmid. At the same time, the untransfection group and negative transfection group were also set up. The expression of miRNA-181a, cell viability, cell growth inhibition and apoptosis rate duringcis-diamminedichloroplatinum (DDP) treatment, cell cycle, cell invasion, the protein expression of miRNA-181a target genesbcl-2andp53 in the A549/DDP cells were determined by real-time fluorescence quantitative PCR, MTT assay, flow cytometry, Transwell method and Western blot, respectivly. RESULTS: The expression of miRNA-181a in A549 cells and A549/DDP cells was significantly lower than that in BEAS-2B cells, and the lowest expression level was observed in A549/DDP cells (P<0.05). The expression of miRNA-181a in A549/DDP cells was significantly increased after transfection with pGenesil-miRNA-181a (P<0.05). The cell viability, cell cycle and invasion ability of the A549/DDP cells were inhibited after miRNA-181a transfection (P<0.05). The cell growth inhibition rate and apoptotic rate of the A549/DDP cells were increased (P<0.05). The expression of Bcl-2 was reduced, but the expression of P53 was increased after transfection with miRNA-181a in A549/DDP cells (P<0.05). CONCLUSION: miRNA-181a may be correlated with the development of human lung adenocarcinoma. miRNA-181a can serve as a new target for treatment of lung cancer.

MicroRNA-181a; A549/DDP cell line; Cell cycle; Apoptosis; Cell invasion

1000- 4718(2016)08- 1395- 08

2015- 12- 24

2016- 05- 25

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.009

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