黃漢超，陳　寧，趙海方

(廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

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加味升降散對病毒感染后小鼠呼吸道上皮VR1表達(dá)及肺內(nèi)P物質(zhì)含量的影響

黃漢超，陳寧，趙海方

(廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

[摘要]目的探討加味升降散對病毒感染后小鼠呼吸道上皮辣椒素受體(VR1)表達(dá)及P物質(zhì)含量的影響。方法將40只SPF級小鼠隨機(jī)分為治療組與對照組，均采用甲型流感病毒FMl株造模，造模成功后治療組予加味升降散灌胃，對照組予蒸餾水灌胃，連續(xù)2周。末次灌胃后24 h處死小鼠,電鏡下觀察呼吸道上皮病理變化，PCR法檢測呼吸道上皮VR1 mRNA表達(dá)量，ELISA法檢測肺組織勻漿上清液中P物質(zhì)含量。結(jié)果治療組小鼠呼吸道上皮VR1 mRNA的表達(dá)量及肺組織勻漿P物質(zhì)含量均明顯低于對照組(P均<0.05)，并且呼吸道上皮纖毛有修復(fù)現(xiàn)象。結(jié)論加味升降散對病毒感染后小鼠呼吸道上皮具有修復(fù)作用。

[關(guān)鍵詞]加味升降散；小鼠；辣椒素受體；P物質(zhì)；病毒感染

感染后咳嗽是臨床常見病、多發(fā)病之一，多以刺激性干咳、咽癢、咳少許白色痰等為主要表現(xiàn)，X射線胸片、血常規(guī)檢查多無異常。該病病程纏綿，可以持續(xù)3～8周甚至更長時間，頻繁的就診不僅加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且還影響患者休息、工作。隨著氣候變遷、大氣污染加重,本病發(fā)病率有上升趨勢。該病發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，可能與變態(tài)反應(yīng)[1]以及神經(jīng)源性刺激[2]等因素有關(guān)。最新的動物實(shí)驗(yàn)研究表明造成感染后咳嗽的原因可能與呼吸道上皮辣椒素受體(VR1)表達(dá)升高、P物質(zhì)釋放增多有關(guān)[3]。筆者在臨床上運(yùn)用加味升降散治療感冒后咳嗽有一定的臨床療效[4]，現(xiàn)擬通過動物實(shí)驗(yàn)了解該藥對小鼠呼吸道上皮VR1的表達(dá)及肺內(nèi)P物質(zhì)含量的影響，旨在闡明該方的作用機(jī)制以及臨床應(yīng)用價值。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1藥品與試劑加味升降散組方：顆蟬蛻1包(相當(dāng)于生藥6 g)， 顆僵蠶1包(相當(dāng)于生藥10 g)， 顆姜黃1包(相當(dāng)于生藥6 g)， 顆大黃1包(相當(dāng)于生藥6 g) ， 顆百部1包(相當(dāng)于生藥10 g)，顆白前1包(相當(dāng)于生藥10 g，顆枳實(shí)1包(相當(dāng)于生藥6 g)， 顆厚樸1包(相當(dāng)于生藥6 g)，顆麻黃1包(相當(dāng)于生藥5 g)， 顆苦杏仁1包(相當(dāng)于生藥10g，顆甘草1包(相當(dāng)于生藥3 g)， 顆桑葉1包(相當(dāng)于生藥10 g)，顆牛蒡子1包(相當(dāng)于生藥10 g)。所選中藥配方顆粒劑由廣東一方制藥有限公司提供。提取RNA的Trizol試劑盒來自Takara公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來自美國DBI公司；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自美國R&D 公司，批號：201403；VR1的上游引物序列為CCGGCTTTTTGGGAAGGGT，下游引物序列為GAGACAGGTAGGTCCATCCAC。

1.2動物40只SPF級NIH小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，雌雄各半，許可證號SCXK(粵)2013-0002。根據(jù)體質(zhì)量末位數(shù)進(jìn)行分組，其中尾數(shù)為1，3，5，7，9的小鼠歸入治療組，尾數(shù)為0，2，4，6，8的小鼠歸入對照組，每組20只。

1.3儀器TGL-16G型高速離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1206型分光光度計(jì)購自日本SHIMODZU公司；PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司；Real time PCR儀購自美國Agilent公司；華東電子DG5033A酶標(biāo)儀購自南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司；ADVIA1800全自動生化分析儀購自德國西門子公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1病毒培養(yǎng)病毒實(shí)驗(yàn)操作在廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所屬下的病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選用甲型流感病毒FMl株，由中國藥品生物檢定所提供，經(jīng)小鼠增強(qiáng)毒力后，于雞胚尿囊腔傳代2次，并測定其半數(shù)致死量。實(shí)驗(yàn)前，取毒種流水沖浸融化，以無菌生理鹽水倍比稀釋成10-5的濃度，放冰水中保存。

1.4.2病毒接種在SPF級環(huán)境下單獨(dú)飼養(yǎng)SPF級小鼠1周左右后開始接種病毒。在乙醚輕度麻醉下，用已滴定流感病毒稀釋液滴鼻感染，每鼠2滴，約0.05 mL，觀察7 d，2組均未發(fā)生死亡。

1.4.3中藥灌胃病毒接種第8天，治療組給予加味升降散溶液灌胃，用100 mL開水融化中藥后放置室溫，每只小鼠每次灌胃0.2 mL，每天2次，連續(xù)灌胃2周；對照組小鼠予蒸餾水灌胃。

1.5檢測項(xiàng)目及方法

1.5.1呼吸道上皮電鏡檢查末次灌胃后24 h處死小鼠并采血完畢后取出一側(cè)肺，用生理鹽水沖洗干凈，在肺門處用無菌手術(shù)刀片橫切厚約1 mm的薄片，用2.5%戊二醛固定液固定后經(jīng)過脫水、浸透、包埋、切片、電子染色后制成電鏡標(biāo)本進(jìn)行觀察。

1.5.2VR1 mRNA表達(dá)量檢測2組病毒接種后7 d及末次灌胃后24 h各處死10只小鼠后取適量右側(cè)肺組織，在液氮中充分研磨，加入Trizol試劑，震蕩混勻室溫放置5 min后加入氯仿進(jìn)行離心處理，取上清液，并根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取、去基因組、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、PCR檢測等。實(shí)驗(yàn)按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。其中，△Ct=(目的基因Ct-內(nèi)參Ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；△△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.3肺內(nèi)P物質(zhì)含量檢測2組病毒接種后7 d及末次灌胃后24 h各處死10只小鼠后取游離右側(cè)肺，取適量肺組織，加入醋酸溶液后100 ℃水浴10 min，然后按比例加入一定量的PBS液，以3 500 r/min的速度離心20 min，取上清液后用ELISA法檢測小鼠肺組織P物質(zhì)的含量，操作及方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4安全性分析在給藥前采用剪尾采血的方法采集標(biāo)本約0.1 mL，給藥后在取小鼠肺前打開胸腔，用1 mL注射器刺入小鼠心臟采血約0.2 mL，查血常規(guī)、肝腎功能(ALT、AST、BUN、Cr)。

2結(jié)果

2.12組小鼠呼吸道上皮電鏡下表現(xiàn)治療組呼吸道黏膜纖毛脫失，排列尚完整，見圖1；呼吸道黏膜上皮尚完整，有部分細(xì)胞脫落，見圖2；呼吸道上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，尚可看到完整的細(xì)胞核，見圖3。對照組呼吸道黏膜纖毛倒伏、脫失嚴(yán)重，排列不完整，見圖4；呼吸道黏膜上皮斷裂，有細(xì)胞脫落，見圖5；呼吸道上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重腫脹，難以看到完整的細(xì)胞器，見圖6。

圖1　治療組小鼠呼吸道上皮纖毛形態(tài)(×100 000)

圖3　治療組小鼠呼吸道上皮細(xì)胞透射電鏡表現(xiàn)(×100 000)

2.22組給藥前后小鼠呼吸道上皮VR1mRNA表達(dá)量及肺組織勻漿P物質(zhì)含量比較2組給藥前及對照組給藥前后R1mRNA表達(dá)量及P物質(zhì)含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，給藥后治療組R1mRNA表達(dá)量及P物質(zhì)含量均明顯低于給藥前及對照組(P均<0.05)。見表1。

圖4　對照組小鼠呼吸道上皮纖毛形態(tài)(×100 000)

圖5　對照組小鼠呼吸道上皮黏膜形態(tài)(×100 000)

圖6　對照組小鼠呼吸道上皮細(xì)胞透射電鏡表現(xiàn)(×100 000)

組別nVR1mRNA表達(dá)量給藥前給藥后P物質(zhì)含量/(ng/mL)給藥前給藥后治療組100.82±0.120.35±0.08①②13.79±1.3610.23±2.26①②對照組100.83±0.110.85±0.1412.86±2.1113.42±2.59

注：①與給藥前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.32組給藥前后安全性指標(biāo)比較2組小鼠給藥前后肝腎功能組內(nèi)、組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2　2組給藥前后安全性指標(biāo)比較±s)

3討論

感染后咳嗽是常見的咳嗽病因之一。近年來多數(shù)學(xué)者認(rèn)為本病主因是病毒感染后通過各種途徑損傷氣道上皮，導(dǎo)致諸如IL-4、IL-8、TNF-α等多種細(xì)胞因子浸潤以及刺激C神經(jīng)纖維、破壞M受體導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)亢進(jìn)，引起乙酰膽堿等遞質(zhì)的釋放以及P物質(zhì)增多，加之纖毛上皮受損并運(yùn)動減弱，對各種刺激物的清除速度減慢，從而刺激咳嗽感受器引起咳嗽，但具體機(jī)制尚未完全明確[5-7]。目前西醫(yī)多以抗過敏、抗感染、霧化吸入β2受體激動劑以解痙平喘等療法為主[8-9]，治療效果不一，并且停藥后咳嗽容易反復(fù)，不少患者遷延難愈。

辣椒素受體廣泛分布于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及呼吸道、消化道上皮中，起初發(fā)現(xiàn)該受體主要與慢性疼痛密切相關(guān)[10]。近年國外研究證實(shí)VR1上調(diào)與慢性咳嗽直接相關(guān)[11]。葉新民等[3]研究發(fā)現(xiàn)，感染后咳嗽動物模型中肺組織VR1表達(dá)顯著上升，并且隨著時間的延長有上升趨勢。VR1激活后可刺激氣道黏膜的C類纖維，導(dǎo)致P物質(zhì)等神經(jīng)肽類物質(zhì)釋放，引起神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性并最終導(dǎo)致氣道重塑。因此拮抗VR1受體、拮抗P物質(zhì)釋放有可能是治療感染后咳嗽的方向之一。但目前仍未有專門針對呼吸道VR1的拮抗劑或拮抗P物質(zhì)藥物的相關(guān)報(bào)道。

感染后咳嗽屬于中醫(yī)學(xué)“外感咳嗽”范疇，一般分為風(fēng)寒咳嗽、風(fēng)熱咳嗽、風(fēng)燥咳嗽幾個類型，臨床常用止嗽散、射干麻黃湯、杏蘇散等治療。筆者認(rèn)為，感染后咳嗽患者多表現(xiàn)為咽癢、咽中刺激感，甚則如氣頂、氣往上沖之感，既有肺氣上逆的一般表現(xiàn),更具風(fēng)動、過敏、氣道攣急、喉癢逆嗆作咳的自身特征，正如清代高世試謂:“若喉癢而咳是火熱之氣上沖也，火越發(fā)而煙先起,煙氣沖喉,故癢而咳?！笨梢姼腥竞罂人院小盎馃嵘瞎ァ敝静C(jī)，故若單純予疏風(fēng)宣肺類方劑治療感染后咳嗽，似乎與病機(jī)未完全相合，其中醫(yī)治法尚應(yīng)包含“清熱、緩急”的一面。從另一角度看，患者此時多以邪實(shí)之表現(xiàn)為主，故治療上如沒有明顯的正虛表現(xiàn)，可先予攻邪為主，是故邪去則正安，否則時間一長，變證迭出，病程更加纏綿。

加味升降散由僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃、百部、白前、甘草、杏仁、麻黃、厚樸、枳實(shí)、桑葉、牛蒡子組成，其中僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃為升降散原方，該方配伍精妙，四藥兩兩相伍，一升一降，具有解痙、通腑瀉熱之效，使邪毒得排，氣機(jī)得暢。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃、蟬蛻具有免疫抑制作用，姜黃、僵蠶具有良好的抗菌活性，四藥合用，具有抗炎、抗過敏、免疫抑制的復(fù)合療效。以此為基礎(chǔ)，合用枳實(shí)、厚樸加強(qiáng)下氣降逆之功；杏仁、麻黃、甘草為三拗湯，合百部、白前、桑葉共奏宣肺化痰、降氣鎮(zhèn)咳之效，使肺復(fù)宣降之職，邪有出路；牛蒡子瀉熱利咽，能直達(dá)病變部位，有引藥之用。諸藥合用，可奏宣肺清熱、祛痰下氣、緩急解痙之功，既無攻伐過當(dāng)之虞，又有啟門逐寇之勢，更切合其中醫(yī)病機(jī)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，甲流病毒是目前常見的感冒病毒之一，也是引起感染后咳嗽的常見病原體之一[12]。升降散能降低感染小鼠肺內(nèi)病毒血凝滴度，具有良好的抑制病毒增殖的作用[13]。小樣本的臨床研究發(fā)現(xiàn)加味升降散對于感冒后咳嗽具有比較好的臨床療效[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠給藥后呼吸道上皮VR1mRNA表達(dá)量及肺內(nèi)P物質(zhì)含量均顯著低于對照組，而且治療組小鼠氣管黏膜上皮纖毛、微絨毛排列較對照組整齊，對照組不僅黏膜不完整，而且呼吸道上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重腫脹，難以看到完整的細(xì)胞器。提示該方對小鼠氣道上皮有一定的修復(fù)作用。提示該方治療感染后咳嗽具有多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，但該方誘導(dǎo)VR1下調(diào)的具體機(jī)制，是否存在量效關(guān)系以及時空效應(yīng)，對于其他神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、肽類神經(jīng)物質(zhì)是否也具有抑制作用，這些都值得進(jìn)一步研究。

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Effect of compound Shengjiang powder on P substance content and VR1 expression in mouse respiratory epithelium after virus infection

HUANG Hanchao, CHEN Ning, ZHAO Haifang

(The Second Hospital of TCM of Guangdong Province, Guangzhou 510095, Guangdong, China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of compound Shengjiang powder on P substance content and vanilloid receptor 1(VR1) expression in mouse respiratory epithelium after virus infection. Methods 40 SPF mice were randomly divided into experimental group and control group, the models were established by influenza A virus FM1 strains in both groups. The experimental group was treated with modified Shengjiang powder by gavage, and the controlled group was treated with distilled water, both groups were treated for 2 weeks. In 24 h after last gavage, the mice were killed and the pathological changes of their respiratory epithelium were observed by electron microscope, and the expression of VR1 mRNA were detected by PCR and the concentration of P substance from mice lung homogenate were measured by ELISA. Results In the treatment group, the concentration of P substance from mice lung homogenate and the expression of VR1 mRNA were lower than that in control group (P<0.05), and the respiratory epithelium also presented repaired tendency. Conclusion The modified Shengjiang powder has a good protective effect on the respiratory epithelium of mice virus infection.

Key words:modified Shengjiang powder；mice; vanilloid receptor 1；P substance; virus infection

[收稿日期]2015-09-16

[中圖分類號]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)01-0015-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.005

[基金項(xiàng)目]廣東省中醫(yī)藥局課題(20131107)

[作者簡介]黃漢超，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合急癥。