龍　旭,吳克明,廖風嬌,陸柳如

(成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610072)

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補腎活血法復方解除雷公藤甲素抑制人卵巢顆粒細胞分泌功能的研究

龍旭,吳克明,廖風嬌,陸柳如

(成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610072)

[摘要]目的探討雷公藤甲素對體外培養(yǎng)人卵巢顆粒細胞增殖的影響及補腎活血中藥復方對此影響的解除作用。方法MTT法檢測雷公藤甲素6種不同濃度對人卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)細胞增殖的影響，并計算出細胞半數(shù)抑制濃度值(IC50)；放免法分別檢測顆粒細胞正常組(正常組)、雷公藤甲素抑制組(TL組)、中藥含藥血清組(TL+中藥組)的雌二醇(E2)、孕酮(P)水平。結(jié)果雷公藤甲素濃度≥1 μg/mL時對人卵巢顆粒細胞的增殖有明顯抑制作用，且呈劑量依耐性；當IC50為5.33 μg/mL時，TL組的E2、P水平明顯低于正常組(P均<0.05)，而TL+中藥組E2、P水平均明顯高于TL組(P均<0.05)。結(jié)論雷公藤甲素能抑制體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞的分泌功能，補腎活血中藥復方能解除其抑制作用，提高體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞的分泌功能。

[關(guān)鍵詞]補腎活血法；人卵巢顆粒細胞；雷公藤甲素；雌二醇；孕酮

卵泡發(fā)育障礙包括卵泡發(fā)育、成熟和排出障礙，主要表現(xiàn)為月經(jīng)量少、月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕等，常見于無排卵性功血、多囊卵巢綜合征、卵巢儲備功能下降甚至卵巢早衰等疾病，臨床上發(fā)病率居高不下，嚴重影響了婦女的生殖和心理健康。祖國醫(yī)學并無“卵泡發(fā)育障礙”這一名稱，隨著近代醫(yī)學對上述病癥的認識，眾多醫(yī)家遵循“腎主生殖”“經(jīng)水出諸腎”“經(jīng)本于腎”的中醫(yī)理論，臨床采用補腎填精法治療，獲得了滿意的療效。卵巢顆粒細胞是卵泡內(nèi)的主要體細胞成分，它介導促性腺激素影響卵母細胞的發(fā)育，并通過自分泌和旁分泌維持卵母細胞成熟的微環(huán)境。本實驗采用雷公藤甲素以影響體外培養(yǎng)顆粒細胞的增殖，計算出其半數(shù)抑制濃度(IC50)，再采用補腎活血中藥復方新加歸腎丸含藥血清進行干預(yù)，以觀察其對受抑制顆粒細胞分泌功能的影響。

1實驗資料

1.1實驗藥物與試劑新加歸腎丸由菟絲子15 g、肉蓯蓉15 g、干地黃10 g、山茱萸10 g、淫羊藿10 g、覆盆子10 g、當歸10 g、茺蔚子10 g組成，生藥總劑量為80 g，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司按《中國藥典》2005年第1版炮制加工成免煎顆粒劑，每80 g生藥相當于免煎顆粒18.4 g。雷公藤甲素(Triptolide，TL，購自上海學匯醫(yī)學科技有限公司)為無色針柱狀結(jié)晶，分析標準品，純度≥99%；DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)、Percoll液、甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Biosharp公司；雌二醇(E2)、孕酮(P)放射免疫試劑盒購自美國Market INC公司。胎牛血清購自杭州四季青公司。所用儀器主要有Tecan infinite M200 pro酶標儀、CO2培養(yǎng)箱。

1.2實驗動物雌性健康成年SD大鼠，清潔級，6周齡，體質(zhì)量160～170 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(川) 2008-24號。在成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥理實驗動物中心分籠喂養(yǎng)，自由飲水攝食，室溫控制在22～25 ℃，濕度為70%。

1.3藥物的配制

1.3.1TL的配制TL晶體用DMSO溶解后加入無血清DMEM培養(yǎng)液配成不同濃度備用。

1.3.2MTT的配制取50 mg MTT粉，溶于10 mL PBS液(0.2 mmol/L，pH值7.2)中，完全溶解后，0.22 μm針頭濾器除菌，分裝4 ℃避光保存。MTT終濃度為5 mg/mL。

1.3.3新加歸腎丸大鼠含藥血清的制備選取新加歸腎丸高劑量灌胃大鼠制備含藥血清。參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表》[1]、《實驗動物學》[2]，新加歸腎丸按成人體質(zhì)量的臨床用藥劑量以人鼠比例換算后20倍(即200 g大鼠每日用藥量相當于70 kg成人每日用藥量的20倍)，折合大鼠的用藥劑量為5.32 g/(kg·d)，將免煎顆粒配成0.532 g/mL溶液，每次以1 mL/100 g灌胃，每日灌胃2次，連續(xù)4d。于末次灌胃后1h大鼠股動脈采血，室溫靜置2h，3 000 r/min離心，取上清液，56 ℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm無菌濾器過濾除菌、分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4卵巢顆粒細胞的采集收集2014年2—5月在四川省人民醫(yī)院生殖中心行常規(guī)體外受精(IVF)或卵胞漿單精子顯微注射(ICSI)治療的不孕癥患者36例，年齡22～38(27.46±4.65)歲，患者均知情同意。36例患者均采用標準長方案降調(diào)節(jié)治療方案促排卵，用藥期間監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及血清E2和LH水平，根據(jù)卵泡情況及時調(diào)整藥量，促排卵后，當患者兩側(cè)卵巢至少有3個卵泡直徑≥18mm時，肌肉注射HCG10 000 IU，34～36 h后在陰道B超監(jiān)測下取卵，收集卵泡液。

1.5人卵巢黃素化顆粒細胞的分離及培養(yǎng)含有顆粒細胞的卵泡液經(jīng)1 000 r/min離心10 min，棄上清。 取細胞沉淀物置入50% Percoll液中，再1 000 r/min離心20 min，回收界面處的顆粒細胞層，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化5～10 min后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中止消化，1 000 r/min離心10 min，棄上清，經(jīng)臺盼藍染色細胞存活率85%～90%，將顆粒細胞濃度調(diào)整為2×105/孔的單細胞懸液備用。整個細胞收集過程要盡快完成，避免引起顆粒細胞額外的損傷。

1.6不同濃度的TL對人卵巢顆粒細胞生長的影響將1.5收集的人卵巢顆粒細胞調(diào)整至1×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔容積為100 μL，每組取4個復孔，分為正常組及6種不同濃度TL組。待細胞貼壁24 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入不同濃度的TL(1×10-3，1×10-2，1×10-1，1，1×101，1×102μg/mL)200 μL，以無血清DMEM培養(yǎng)基作為空白對照組，36.5 ℃,5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.7MTT法檢測人卵巢顆粒細胞的增殖功能6種不同濃度的TL處置48 h后，選擇490 nm(校正630 nm)波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔的吸光度(OD)值，分別記錄TL作用于人卵巢顆粒細胞的濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)，用IC50軟件進行相應(yīng)處理，得出TL對卵巢顆粒細胞的IC50值。細胞抑制率=(對照組-實驗組)/對照組×100%。

1.8新加歸腎丸與TL聯(lián)用對人卵巢顆粒細胞分泌E2、P的影響將1.5收集的人卵巢顆粒細胞調(diào)整至1×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔體積為100 μL，每組取4個復孔，待細胞貼壁24 h后吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，分為正常組、TL組、TL+中藥組。正常組加入無血清培養(yǎng)液200 μL；TL組加入IC50濃度的TL 200 μL；TL+中藥組加入IC50濃度的TL和新加歸腎丸含藥血清共200 μL，36.5 ℃,5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，應(yīng)用放射免疫法檢測E2、P水平。

2結(jié)果

2.1TL對人卵巢顆粒細胞增殖的影響原代培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞經(jīng)TL處理后，細胞增殖受到明顯抑制，抑制率為12.34%～81.33%，呈劑量依賴性，最小有毒劑量為1 μg/mL，見表1。細胞IC50為5.33 μg/mL。

表1　不同濃度的TL對卵巢顆粒細胞

2.2各組卵巢顆粒細胞分泌E2、P水平比較TL組顆粒細胞分泌E2、P水平均明顯低于正常組(P均<0.05)，TL+中藥組顆粒細胞分泌E2、P水平均明顯高于TL組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組卵巢顆粒細胞分泌E2、P水平比較±s)

注：①與正常組比較,P<0.05；②與TL組比較,P<0.05。

3討論

在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞起著支持、營養(yǎng)卵母細胞的功能，并且介導著促性腺激素對卵母細胞成熟的調(diào)節(jié)，通過自分泌和旁分泌作用，維持有利于卵母細胞成熟的微環(huán)境。有研究表明，顆粒細胞的凋亡遠早于卵泡閉鎖的形態(tài)學的變化，亦就是顆粒細胞凋亡達到一定程度后才表現(xiàn)出卵泡閉鎖現(xiàn)象[3]。所以，只有顆粒細胞獲得抗凋亡的能力，卵泡才能維持其活力，直到排卵[4]。卵泡發(fā)育障礙的主要特征是卵泡發(fā)育、成熟及排出均出現(xiàn)異常，導致月經(jīng)失調(diào)、不孕癥、多囊卵巢綜合征、卵泡黃素化不破裂綜合征等臨床病癥。西醫(yī)對此的治療主要從調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸，通過促排卵方法誘發(fā)卵泡發(fā)育，調(diào)節(jié)體內(nèi)E2、P的水平，促進卵泡生長及排卵。祖國醫(yī)學則從腎論治，本因在于腎氣虧虛。夏桂成[5]認為腎陰不足，癸水不充，精卵失養(yǎng)，不能發(fā)育成熟。吳克明認為卵泡發(fā)育障礙的病機在于腎虧精少，腎氣不足，天癸不能按期泌至，沖任二脈不得相資；腎精化血不足，血虛沖任血海匱乏；腎氣虛弱，鼓動無力；腎氣虛弱或腎中陰陽失衡，瘀血阻滯沖任胞宮，沖任氣血不暢，導致卵子失于濡養(yǎng)，不能正常發(fā)育、排出及受孕[6]。劉涓[7]認為卵子作為生殖之精，它的成熟有賴于腎精的滋養(yǎng)、腎氣的推動和促進作用。若腎虧精少，腎氣不足，則沖任胞脈失于濡養(yǎng)，沖任氣血不暢，氣血易停滯而瘀阻，瘀阻胞脈而影響二精相合，致不孕。故補腎益精、養(yǎng)血活血是促卵泡發(fā)育和治療卵巢功能低下的根本大法[8]。多項臨床和動物實驗研究表明，補腎中藥可通過促進卵泡發(fā)育，延緩卵巢顆粒細胞衰老，改善卵巢功能，進而改善各種臨床癥狀[9-10]。

新加歸腎丸是由新加肉蓯蓉菟絲丸化裁而來，臨床上用于月經(jīng)稀發(fā)、月經(jīng)過少、卵巢早衰、卵泡發(fā)育不良、多囊卵巢綜合征等婦科病癥，療效顯著。方中肉蓯蓉、菟絲子、淫羊藿益腎精，溫腎陽；枸杞子、山茱萸滋補腎陰，肝腎同補；干地黃滋陰養(yǎng)血，去熟地之滋膩，其性微寒，又能牽制淫羊藿之溫燥；當歸既能助干地黃養(yǎng)血，又能活血調(diào)經(jīng)，使補而不滯，靜中有動，動中有補。全方共奏益腎填精、養(yǎng)血活血之功效，具有陰陽雙補、動靜結(jié)合、溫而不燥、滋而不膩、通補共濟之特點?，F(xiàn)代藥理學研究表明，菟絲子的主要有效成分菟絲子黃酮能夠促進下丘腦-垂體-性腺軸功能，提高垂體對促性腺激素釋放激素的反應(yīng)性，促進卵泡發(fā)育，提高應(yīng)激大鼠雌二醇、黃體酮的水平，同時也能提高垂體促黃體生成素的水平；菟絲子作為一種免疫增強劑，能夠參與體內(nèi)多種免疫調(diào)節(jié)，增強機體的免疫功能[11-12]。有研究表明，卵巢動脈供血不足可能造成卵泡發(fā)育障礙；而當歸既能活血化瘀又能養(yǎng)血，可降低血液黏稠度，提高卵巢血供，改善卵巢微環(huán)境，進而促使卵泡發(fā)育和排出[13]。范培等[14]研究發(fā)現(xiàn)補腎活血法聯(lián)合熱敏灸可降低子宮動脈血流阻力指數(shù)，促進卵泡發(fā)育成熟及子宮內(nèi)膜生長，提高臨床受孕率。

曹俊巖[15]觀察發(fā)現(xiàn)新加歸腎丸可增加雷公藤多苷致卵泡發(fā)育障礙大鼠模型體質(zhì)量，升高模型大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)及血清E2與P水平，降低IGF-1水平，使模型大鼠卵巢組織ERβ、VEGF及Flk-1表達增加；增加各級卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)/卵泡總數(shù)及黃體數(shù)，減弱FSHR表達；且可使卵巢血管壁變薄，管腔增寬。蔡競等[16]研究發(fā)現(xiàn)新加歸腎丸能增加雷公藤多苷致大鼠卵泡發(fā)育障礙模型顆粒細胞厚度，中、高劑量能提高cyclinD2mRNA及顆粒細胞cyclinD2蛋白表達量。

本實驗選用人卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)為實驗基礎(chǔ)，利用TL的生殖毒性，研究發(fā)現(xiàn)TL對體外培養(yǎng)的顆粒細胞同樣有抑制生長的作用，當TL濃度在1 μg/mL時對人卵巢顆粒細胞的增殖有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性，其IC50為5.33 μg/mL。選用IC50濃度的TL作用于顆粒細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2、P水平均明顯降低，證明TL對體外培養(yǎng)顆粒細胞有抑制作用；而加入新加歸腎丸大鼠含藥血清后， E2、P水平均明顯增高，說明新加歸腎丸可解除TL對顆粒細胞的抑制，增加E2、P的分泌量。本研究為補腎活血法臨床用于治療卵泡發(fā)育障礙性疾病提供了細胞體外培養(yǎng)的實驗依據(jù)，并為進一步探討其分子生物學作用機制奠定了基礎(chǔ)。

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The stimulation of kidney-supplement and blood-activation formula on the endocrine function of human ovary granule cell inhibited by Triptolide: An experimental study

LONG Xu, WU Keming, LIAO Fengjiao, LU Liuru

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan, China)

Abstract:Objective It is to study the inhibition of triptolide on the vitro human ovary granule cell and the stimulation of the kidney-supplement and blood-activation formula on the endocrine function of the inhibited human ovary granule cell. Methods The human ovary granule cells were primary-cultured with 6 different densities of triptolide and were tested with MTT. The IC50of triptolide were calculated accordingly. The radioimmunoassay were used to test the normal granule cell (normal group), IC50triptolide granule cell (TL group) and the Xinjiaguishenwan serum granule cell (TL+XJGSW group) for the E2 and P. Results The triptolide with the density of over 1 μg/mL had shown obvious inhibition to the human ovary granule cell proliferation with dosage dependent. When the IC50of granule cell inhibition was 5.33 μg/mL, the levels of E2 and P of TL group were significantly lower compared to the normal group (P all<0.05), while the levels of E2 and P of the TL + XJGSW group were significantly higher than that of TL group. Conclusion Triptolide can inhibit the endocrine function of the vitro human ovary granule cell, kidney-supplement and blood-activation formula could relieve the inhibition and improve endocrine function of the vitro human ovary granule cell.

Key words:kidney-supplement and blood-activation; human ovary granule cell; triptolide; estradiol; progesterone

[收稿日期]2015-03-15

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)02-0126-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.004

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81173289)

[作者簡介]龍旭，女，副主任醫(yī)師，博士，從事中醫(yī)藥調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌的研究工作。[通信作者]吳克明，E-mail：18981885621@163.com