任清風，李煒娟，徐群英，張中偉，李偉，馮建高，任曉慧，肖元梅?

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飲水鉛暴露對大鼠腦組織APE1表達的影響及與氧化應(yīng)激的關(guān)系研究

任清風1,2，李煒娟1,3，徐群英1，張中偉1，李偉1，馮建高1，任曉慧1，肖元梅1?

摘要：目的探討飲水鉛暴露對大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、海馬組織中脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（APE1）表達的影響及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系。方法40只剛斷乳雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機區(qū)組法均分為5組，對照組自由飲用去離子水，4個鉛暴露組分別飲用100、200、400和800 mg/L醋酸鉛溶液，連續(xù)染毒60 d后，取大腦皮質(zhì)、小腦和海馬組織，測定各組的超氧化物歧化酶（SOD）活力、過氧化氫（H2O2）水平和丙二醛（MDA）含量，蛋白印跡法檢測APE1蛋白在各組織中的表達。結(jié)果鉛暴露后，大腦皮質(zhì)、小腦、海馬中APE1蛋白表達水平均低于對照組，且隨染鉛劑量的升高呈逐漸下降趨勢（P＜0.05）；隨著染鉛劑量的升高，大腦皮質(zhì)、小腦和海馬中的SOD活力基本呈下降趨勢；而H2O2及MDA含量隨染鉛劑量的升高基本呈逐漸升高趨勢，大腦皮質(zhì)、小腦和海馬組織的APE1蛋白表達水平與其SOD活力呈正相關(guān)（r分別為0.619、0.380、0.375，P < 0.05）,而與H2O2水平和MDA含量呈負相關(guān)（r分別為-0.472、-0.535、-0.436，-0.514、-0.486、-0.316，P < 0.05）。結(jié)論飲水鉛暴露可導致大鼠腦組織APE1蛋白表達水平改變，且此種改變與鉛所致的氧化應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鉛；腦組織；氧化應(yīng)激；脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1；超氧化物歧化酶；過氧化氫；丙二醛

?通訊作者E-mail:xym72@163.com

鉛既是主要的環(huán)境和食品污染物，也是常見的工業(yè)毒物。鉛具有很強的毒性，其中最嚴重的健康危害是神經(jīng)毒性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous sys?tem,CNS)是鉛發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的主要靶器官之一[1]。然而鉛神經(jīng)毒性的確切機制目前仍不清楚。有文獻報道誘導氧化應(yīng)激是鉛神經(jīng)毒性的機制之一[2-3]。低濃度鉛可通過誘導細胞發(fā)生氧化應(yīng)激而損傷細胞膜、DNA及抗氧化防御系統(tǒng)[4]。DNA氧化性損傷是氧化應(yīng)激損傷的一種最突出的表現(xiàn)形式[5]，且DNA氧化損傷最終往往會導致機體細胞的凋亡、衰老及腫瘤的發(fā)生，而DNA堿基切除修復（BER）是針對這類損傷的主要修復途徑[6]。脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（APE1）的主要功能就是在DNA BER途徑中發(fā)揮重要作用，其還可介導轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原調(diào)控[7]，但有關(guān)鉛暴露對APE1蛋白的影響尚少見報道。本研究通過分析鉛暴露后大鼠腦組織中APE1的表達水平變化及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系，為進一步探討鉛神經(jīng)毒性機制提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器三水合乙酸鉛（分析純，西隴化工廠）；組織蛋白質(zhì)提取試劑盒（美國OMEGA公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；β-actin鼠單克隆抗體（美國earthox公司）；Anti-APE1兔多克隆抗體（英國abcam公司）；組織蛋白質(zhì)測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。TS-1搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-RAD公司）；QYDO-10A去離子水系統(tǒng)（美國millipore公司）；低溫高速離心機（德國Thermo公司）。

1.2實驗動物分組及處理40只剛斷乳SPF級健康、雄性SD大鼠，體質(zhì)量90～100 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量采用隨機區(qū)組法分為對照組和4個鉛暴露組，每組8只，對照組自由飲用去離子水，4個鉛暴露組分別飲用100、200、400、800 mg/L的醋酸鉛溶液，動物染毒和組織處理方法參照肖元梅等[8]的方法。

1.3檢測指標及其方法（1）按試劑盒說明書操作檢測腦組織的SOD活力、H2O2水平和MDA含量[8]。（2）蛋白印跡法（Western blotting）檢測腦組織APE1表達：按試劑盒所示方法提取組織蛋白后，測定蛋白濃度，常規(guī)經(jīng)過制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗及曝光等步驟，用IPP （Image Pro Plus 6.0）軟件分析目的蛋白APE1條帶光密度（OD）值和內(nèi)參β-actin條帶OD值，最后計算目的蛋白/內(nèi)參的OD比值，從而得出APE1蛋白在皮質(zhì)、小腦和海馬中的相對表達量。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織中APE1蛋白表達水平比較鉛暴露后，大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和海馬中的APE1蛋白表達水平，200、400、800 mg/L組均低于對照組，100 mg/L組小腦中的APE1水平也低于對照組（P＜0.05）；且基本隨鉛濃度的升高，APE1蛋白水平呈逐漸下降趨勢，見表1。

Tab. 1 Comprison of APE1 protein level in rat brain tissue between five groups表1　各組大鼠腦組織中APE1蛋白表達水平比較（n=8,±s）

Tab. 1 Comprison of APE1 protein level in rat brain tissue between five groups表1　各組大鼠腦組織中APE1蛋白表達水平比較（n=8,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;a與對照組比較,b與100 mg/L組比較,P<0.05

組別對照組100 mg/L組200 mg/L組400 mg/L組800 mg/L組F APE1大腦皮質(zhì)0.661±0.118 0.577±0.109 0.479±0.097a0.416±0.088ab0.388±0.043ab9.630＊＊小腦1.348±0.309 1.007±0.158a0.983±0.237a0.952±0.255a0.945±0.037a4.168＊＊海馬0.767±0.081 0.725±0.117 0.671±0.139a0.614±0.094a0.591±0.058ab3.653＊

2.2各組大鼠腦組織中SOD、H2O2和MDA含量比較鉛暴露組大腦皮質(zhì)、小腦和海馬中的SOD活力均低于對照組，并隨著染鉛劑量的升高，SOD活力基本呈下降趨勢；而H2O2及MDA含量基本隨染鉛劑量的升高呈逐漸升高趨勢，見表2～4。

Tab. 2 Comprison of the SOD activity in rat brain tissues between five groups表2　各組大鼠腦組織SOD活力比較（n=8,U/mg prot，±s）

Tab. 2 Comprison of the SOD activity in rat brain tissues between five groups表2　各組大鼠腦組織SOD活力比較（n=8,U/mg prot，±s）

＊＊P＜0.01;a與對照組比較,b與100 mg/L組比較,c與200 mg/L組比較, P < 0.05

組別對照組100 mg/L組200 mg/L組400 mg/L組800 mg/L組F大腦皮質(zhì)552.88±77.93 273.13±60.18a219.14±72.88a192.56±16.66ab151.55±42.17abc59.977＊＊SOD小腦220.22±61.47 183.95±51.32a162.59±23.53a134.43±38.74ab96.70±29.76abc9.481＊＊海馬376.58±112.11 240.96±70.01a221.10±57.98a137.92±52.74ab98.32±40.88abc18.341＊＊

2.3大鼠腦組織中APE1蛋白水平與氧化應(yīng)激的關(guān)系大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和海馬的APE1蛋白表達水平與其SOD活力呈正相關(guān)，與H2O2水平及MDA含量呈負相關(guān)（均P＜0.05），見表5。

3　討論

DNA氧化性損傷是氧化應(yīng)激損傷的一種最突出的表現(xiàn)形式[5]，主要以氧化性堿基損傷為主，并可能最終導致機體細胞的凋亡、衰老及腫瘤的發(fā)生。為了應(yīng)對包括DNA氧化損傷在內(nèi)的多種DNA損傷，維持基因組的完整性，生物體在進化過程中形成了相應(yīng)的修復機制。BER是氧化應(yīng)激誘導的DNA氧化損傷的主要修復途徑，主要清除小的、非螺旋化的可能在復制過程中發(fā)生突變或?qū)е聠捂湐嗔训牡头肿覽6,9]。

Tab. 3 Comprison of the H2O2content in rat brain tissues between five groups表3　各組大鼠腦組織H2O2含量比較（n=8, mmol/g prot，±s）

Tab. 3 Comprison of the H2O2content in rat brain tissues between five groups表3　各組大鼠腦組織H2O2含量比較（n=8, mmol/g prot，±s）

＊＊P＜0.01;a與對照組比較,b與100 mg/L組比較, P < 0.05

組別對照組100 mg/L組200 mg/L組400 mg/L組800 mg/L組F大腦皮質(zhì)16.37±3.33 20.03±2.29 23.17±5.32a25.49±9.00ab26.85±1.29ab5.653＊＊H2O2小腦9.20±0.58 14.97±1.71a15.51±1.96a16.44±2.11a17.38±2.53ab22.880＊＊海馬11.93±1.31 13.11±2.07 14.69±2.06a15.35±2.96ab16.02±1.34ab5.381＊＊

Tab. 4 Comprison of the MDA content in rat brain tissues between five groups表4　各組大鼠腦組織MDA含量比較（n=8,μmol/g prot，±s）

Tab. 4 Comprison of the MDA content in rat brain tissues between five groups表4　各組大鼠腦組織MDA含量比較（n=8,μmol/g prot，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;a與對照組比較,b與100 mg/L組比較,c與200 mg/L組比較,d與400 mg/L組比較, P < 0.05

組別對照組100 mg/L組200 mg/L組400 mg/L組800 mg/L組F大腦皮質(zhì)0.87±0.17 1.09±0.36 1.15±0.14 1.31±0.15a1.49±0.46ab3.735＊MDA小腦0.61±0.11 0.65±0.10 0.81±0.19ab0.84±0.09ab0.98±0.06abcd13.132＊＊海馬0.66±0.12 1.06±0.28a1.16±0.16a1.19±0.38a1.21±0.21a6.838＊＊

Tab. 5 The correlation between APE1 protein level and oxidative stress index in rat brain tissues表5　大鼠腦組織APE1蛋白表達水平與氧化應(yīng)激指標相關(guān)性分析?。╮）

APE1主要在DNA BER途徑中發(fā)揮重要作用。APE1是BER過程中主要的限速酶，其在這一過程作為脫嘌呤、脫嘧啶位點（AP位點）核酸內(nèi)切酶發(fā)揮重要作用[10]。這一過程中，APE1能夠水解AP位點5′磷酸二酯酶鍵產(chǎn)生一個含有3′羥基和5′脫氧核糖磷酸末端的單鏈DNA中間體[11]。

Kelley等[12]研究發(fā)現(xiàn)APE1的DNA修復作用是受氧化還原調(diào)控的。研究發(fā)現(xiàn)，各種氧化性物質(zhì)可以在數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)引起APE1蛋白水平的暫時上調(diào)，表明了APE1在細胞或機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時發(fā)揮重要作用[13]。也有研究表明，APE1蛋白水平的上調(diào)與氧化還原活性和AP核酸內(nèi)切酶活性的增強相關(guān)，從而使細胞對氧化應(yīng)激和DNA損傷物質(zhì)的抵抗性增強[14]。

本研究結(jié)果表明，鉛暴露誘導大鼠神經(jīng)組織氧化應(yīng)激時腦組織內(nèi)的APE1蛋白表達水平下降。Yao等[15]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌HT29細胞受到氧化應(yīng)激損傷時APE1的蛋白水平下調(diào)，與本研究結(jié)果相同。可能是氧化應(yīng)激損傷損害了與APE1蛋白表達途徑的某個環(huán)節(jié)，也可能是鉛直接起到抑制APE1蛋白合成的作用。本研究結(jié)果還顯示，鉛暴露大鼠腦組織中的SOD活力均低于對照組；H2O2、MDA高于對照組，提示鉛可通過促進活性氧自由基的產(chǎn)生、抑制抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)、導致脂質(zhì)過氧化損傷而致腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。

結(jié)合本次研究結(jié)果和國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，當機體處于氧化應(yīng)激損傷時，APE1蛋白的表達水平可能早期能夠在ROS的刺激下短暫上調(diào)，但是隨著機體或細胞氧化損傷程度的不斷加重，其蛋白表達水平最終也會下降，但是其中的具體機制仍需進一步的研究。

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(2015-09-10收稿2015-10-20修回)

（本文編輯閆娟）

作者單位：1南昌大學公共衛(wèi)生學院（郵編330006）；2九江學院臨床醫(yī)學院·附屬醫(yī)院；3南昌大學撫州醫(yī)學院

Effects of lead exposure through drinking water on expression of APE1 protein and their relationships with oxidative stress in brain tissues of rats

REN Qingfeng1,2, LI Weijuan1,3, XU Qunying1, ZHANG Zhongwei1, LI Wei1, FENG Jiangao1, REN Xiaohui1, XIAO Yuanmei1?
1 School of Public Health, Nanchang University, Nanchang 330006，China；2 Clinical Medical College, Jiujiang University；3 Fuzhou Medical College of Nanchang University
?Corresponding Author E-mail: xym72@163.com

Abstract:Objective To observe the effects of lead exposure through drinking water on the expression of APE1 pro?tein in cerebral cortex, cerebellum and hippocampus of rats and its relationship with oxidative stress. Methods Forty weaned male SD rats were randomly assigned to five groups (control group and four exposure groups) according to body weights of rats. Rats in control group were given deionized water as drinking water. Rats in four exposure groups were given 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L and 800 mg/L lead acetate solution for 60 days. The activity of superoxide dismutase (SOD), the contents of hydrogen peroxide (H2O2) and malondialdehyde (MDA) in cortex, cerebellum and hippocampus were mea?sured using kits. The protein level of APE1 in cortex, cerebellum and hippocampus were detected by Western blotting assay. Results After being exposed to lead, the APE1 protein levels were significantly decreased in cortex, cerebellum and hippo?campus (P < 0.05). The protein level showed a trend of gradual decline with the increase of exposed lead (P < 0.05). With the increase of dye lead dose, the activity of SOD in cortex, cerebellum and hippocampus showed a downward trend, while the contents of H2O2and MDA showed a rising trend. The activity of SOD was positively correlated with APE1 protein level in cortex, cerebellum and hippocampus (r=0.619, 0.380 and 0.375，P < 0.05). While the contents of H2O2and MDA were neg?atively correlated with APE1 protein level in cortex, cerebellum and hippocampus (r=-0.472,-0.535,-0.436,-0.514,-0.486 and -0.316，P < 0.05). ConclusionLead exposure through drinking water can affect the expression of APE1 protein through inducing oxidative stress in brain tissues of rats.

Key words:lead; brain tissue; oxidative stress; APE1; superoxide dismutase；hydrogen peroxide；malonaldehyde

中圖分類號：R994.4

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150148

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81160342）；江西省自然科學基金資助項目（20122BAB205047）；江西省教育廳科技項目（GJJ11312）

作者簡介：任清風（1988），男，碩士研究生，主要從事重金屬中毒機制與防治研究